Rap1在精子发生和人无精子症中的作用

Rap1是原癌基因Ras家族成员之一，可通过多个重要信号传导途径参与并调控细胞生长、分化、细胞因子合成、趋化反应等过程。我们在先前对小样本人无精子症及正常睾丸差异基因表达的研究中发现并证实Rap1表达显著改变：无精子症睾丸生精细胞内Rap1 表达明显增强；进一步研究发现Rap1表达增强同时伴有多个MAPK信号通路重要分子表达发生改变，而钙粘素家族成员CDH13、CDH18及原钙粘素PCDH17表达下降，提示Rap1与MAPK信号通路在精子发生障碍过程中具有重要的作用，该过程有钙粘素家族成员的参与。为研究Rap1在精子发生和人无精子症中的作用，拟应用分子生物学结合形态学相关技术，研究Rap1在正常人睾丸组织中的表达特征;重点研究Rap1对精子发生的作用及机制，Rap1在精子生成过程中与MAPK信号通路分子以及细胞黏附分子的关系，同时研究Rap1与MAPK信号通路在无精子症中的作用及临床意义。

目的:Rap1是一种在真核生物广泛表达的GTP结合蛋白，参与着体内多种生物学活动。在之前研究中我们已经证实其在不育男性生精细胞中表达升高。推测其可能参与调节生精细胞的增殖和分化，调控精子的发生，为进一步明确Rap1在生精过程中的作用，我们研究了其在大鼠睾丸发育以及生精细胞凋亡过程中的表达，对其可能的作用机制进行了探讨。方法:1. 使用不同固定试剂固定大鼠生精细胞各发育阶段睾丸组织进行免疫组织化学染色，了解Rap1在发育中的表达规律。蛋白质免疫印迹研究Rap1在总体睾丸的表达水平。2. MAA(650mg/kg)腹腔注射建立大鼠精母细胞凋亡模型，采用免疫组织化学、TUNEL、蛋白质免疫印迹杂交研究Rap1在生精细胞凋亡过程中表达的变化，并使用间接免疫荧光、免疫共沉淀研究Rap1与NF-κB的相互作用关系。结果:1. 在大鼠睾丸组织中，P1和P7生精细胞可见到Rap1表达，从P15开始，Rap1表达于精母细胞核旁的高尔基体并逐渐增强，成年大鼠精母及圆形精子细胞核旁出现Rap1的表达。2. 在MAA腹腔注射6h大鼠睾丸中，Rap1、NF-κB以及TUNEL染色阳性的粗线期精母细胞在VIII-XIV期小管内开始出现，到12h及24h阳性细胞数明显增多。3. Rap1间接免疫荧光及TUNEL染色提示：MAA动物模型中各时间点在VIII-XIV期生精小管可见Rap1与TUNEL细胞核内的共定位，各处理组Rap1+TUNEL阳性细胞数显著高于对照组 (P < 0.01)。4. Rap1和NF-κB双标记间接免疫荧光提示在实验组，两种蛋白在VIII-XIV期粗线期精母细胞核内共定位细胞百分率分别为75.6%、91.8%、94.6%。NF-κB与Rap1免疫共沉淀分析提示，MAA处理组NF-κB结合的蛋白中Rap1的表达明显强于对照组。结论:1. Rap1在大鼠睾丸发育过程中表达于生精细胞的胞核和高尔基体，可能参与了睾丸发育过程中生精细胞的基因调控。.2. Rap1和NF-κB在MAA诱导的凋亡的生精细胞中表达明显升高，并且均发生入核并共定位，免疫共沉淀结果提示两种蛋白存在相互作用，提示Rap1可能与NF-κB相互作用介导生精细胞凋亡。