乙肝表面抗原调节浆样树突状细胞功能在逃避宿主固有免疫中的作用

浆样树突状细胞（pDCs）及其分泌的干扰素在宿主抗病毒免疫中扮演了重要角色。慢性乙型肝炎（CHB）患者体内pDCs的功能受损，但迄今为止机制尚不清楚。在前期研究中我们发现，CHB患者pDCs功能的恢复与血清乙肝表面抗原（HBsAg）滴度呈负相关（r=-0.533，p<0.05），并在体外实验中证实HBsAg能直接抑制pDCs 分泌IFNα。由此认为，HBV通过HBsAg抑制pDCs的功能，逃避宿主固有免疫，建立持续性感染。本研究拟借助流式细胞仪、免疫共沉淀、免疫印迹等方法集中探讨HBsAg对IFNα诱生通路及调控通路的影响，主要包括对信号分子蛋白表达与修饰、核转运功能的影响等，初步阐明HBsAg抑制pDCs分泌IFNα的机制。并在此基础上，借助瞬时转染、定点突变等方法寻找HBsAg发挥抑制作用的关键结构域。研究结果有助于阐明HBV感染慢性化的机制，为开发新型抗HBV药物提供理论基础。

国内外文献均已证实，CHB患者pDCs分泌IFNα的能力下降，且认为HBsAg与pDCs功能下降有关。.从健康人外周血（400ml）分离PBMCs，分选并验证pDCs阳性细胞纯度≥95%。将分选得到的pDCs分为4组，即CpG ODN2216+HBsAg（20ug/ml）组、CpG ODN2216组、HBsAg组和PBS组，将各组细胞在体外培养48小时。荧光标记培养细胞，激光共聚焦显微镜检查显示大量的HBsAg被pDCs吞到了细胞内部。流式细胞术分析了CD40、 CD80、 CD83和 CD86的表达情况；ELISA检测培养上清中INFa和IL-12的表达水平。结果显示HBsAg抑制pDCs的成熟及分泌功能。.收集培养细胞行基因芯片实验，在HBsAg（20ug/ml）条件下，pDCs基因表达谱的变化。获取候选基因。从7个候选基因中进行验证出三个基因(WNT11, PRRG2, NACAD)与基因芯片结果一致。采用siRNA方法，通过检测细胞核内IRF7的浓度以及培养上清中IFNa浓度，发现只有将PRRG2沉默后，才能逆转HBsAg对pDCs的影响。因此，进一步研究PRRG2蛋白对pDCs产生IFNa信号通路的影响。用免疫沉淀的方法收集MyD88复合物，并用W.B方法检测IRAK1,IRAK4，TRAF6蛋白水平。结果显示， HBsAg处理后，IRAK1,IRAK4，TRAF6的表达水平升高；PRRG2基因沉默后，上述蛋白的表达降低。说明，PRRG2通过MyD88信号通路参与了HBsAg抑制pDCs分泌IFNa的过程。.进一步收集临床血清标本，拟进一步深入研究PRRG2在HBV感染慢性化进程中的作用。