利用患者特异性iPS细胞诱导生成的晶体细胞鉴定老年性白内障基因表达特征的研究

Age-related cataract (ARC) is a complex disease involving genetic and enviromental factors. Most studies of this disease focused on the expression and modification of a single gene or protein, and because of the scarce source of healthy lens cells, it's common to use lens from individuals who are not in the same age group as control material. In this research, we use induced pluripotent stem (iPS) cells induced from the ARC patient's lens epithelial cells (LECs) to differentiate healthy LECs. Thus, when hereditary factors are not considered, the healthy lens cells of the patient are generated which can be used as the optimal control for the study of abnormal lens cells. Furthermore, we will use the new generation Chip technology (GG-H Array) to test and compare the differnetial gene expressions between the abnormal and healthy LECs, in which way we can systematically identify the ARC-related genes that can be used for drug and physical therapy test to prevent and cure the disease in future.

老年性白内障的发病受遗传和环境两大因素影响，目前关于该疾病的基础研究集中在单个基因或蛋白质的表达、修饰，且由于取得人体正常的健康晶体细胞困难较大，大部分实验所用的对照组细胞并不是来自同年龄段的人的晶状体。本课题研究的是将诱导自老年性白内障患者的晶体上皮细胞的诱导性多潜能干细胞（induced pluripotent stem cells）继续诱导分化成正常的晶体上皮细胞，这样，在不考虑遗传因素的前提下，我们就又得到了患者发病前的健康晶体上皮细胞，从而为研究病态的晶体细胞提供了最佳的健康对照。进一步的，我们将利用新一代基因芯片技术（GG-H Array）检测和比较晶体上皮细胞在病态和健康状态下的基因表达差异，从而系统的鉴定出老年性白内障发病的相关基因,为临床研究有效预防老年性白内障的药物和方法提供思路。

白内障的发生起始于活跃的晶体上皮细胞及其邻近的纤维细胞。因此对于白内障发生在细胞水平的机制研究大多数集中在对晶体上皮细胞的研究。然而，越来越多的证据表明来源于永生化的细胞系（如HLE-B3，HLE-SRA01/04)的晶体上皮细胞经过传代后性质已经发生改变，不能保持其特性。最主要的特征是无法像原代晶体上皮细胞一样持续的大量的表达晶体蛋白（crystallins）。 由于原代细胞的培养效率低，来源少，且一般只能传2到3代，因此无法大量生成以供白内障机制在细胞水平上的研究。为了解决这一问题，本课题致力于从病人特异性的多潜能干细胞有效的生成大量的真实的（即接近原代细胞的）人体晶体上皮细胞，并取得了一系列有效的实验结果。我们将白内障手术的剩余物，行环形撕囊术后的前囊膜片段取出，用作原代晶体上皮细胞的培养。我们用Yamanaka发明的慢病毒转染四个转录因子：Oct4, Sox2, Klf4和c-Myc的方式将原代晶体上皮细胞成功转化成多潜能干细胞。我们对这株来源于老年性白内障病人的干细胞进行了严格的鉴定，包括干细胞分子标志物荧光染色鉴定，核型分析鉴定，小鼠畸胎瘤成瘤切片染色鉴定，以确认这株干细胞的多潜能分化的能力。然后我们采用已报道的一种诱导法，分三步加入生长因子Noggin, BMP4, BMP7, bFGF, Wnt-3a, 将多潜能干细胞向晶体上皮细胞的前体细胞方向定向分化。我们改良了该方法，大大缩短了诱导时间（从40天缩短为18天），并在最后一步将Wnt-3a（原方法是用于诱导晶状小体（lentoid body）的生成）替换为EGF，并在分化过程中加入了两步筛选，一步是根据干细胞开始分化时的形态，物理性的挑选一些克隆，第二步是待这些挑选出来的克隆增殖后用克隆环消化下来再增殖。经过这两步分离，我们成功得到了形态均一的类似于晶体上皮细胞的大量分化细胞。经过一系列的生物化学鉴定，包括qPCR，western blot，免疫荧光染色，基因芯片（将分化细胞与原代细胞的基因表达对比），我们认为我们得到了较为接近原代晶体上皮细胞的类晶体上皮细胞。这个方法最大的优点在于利用干细胞无限的增殖能力可以高效的获得大量的持续高表达晶体蛋白的晶体上皮细胞，从而为白内障机制研究和药物筛选提供可靠的足够多的细胞材料，提高相关研究的真实性、有效性。