miR196a-NR6A1调节睾丸支持细胞连接及血睾屏障功能的作用机制

The blood-testis barrier（BTB）is a physical barrier formed by the tight junction of sertoli-sertoli and sertoli-germ cells. Spermatogenesis is required for the dynamic regulation of BTB. Studies have shown that TGFβ1 is a key molecule involving in BTB permeability via regulation of cell junctions. In our previous study, it was found that the expression of miR196a and its target NR6A1 could be regulated by TGFβ1. Further study showed that miR196a is specific-expressed in testis and involved in sertoli cell junctions. Therefore, it is hypothesized that there might be a new pathway of NR6A1 down-regulated by TGFβ1-miR196a during the process of regulating testicular development. NR6A1 might play some role in sertoli cell junctions and participate in regulating formation of BTB and spermatogenesis. Based on this hypothesis, by using primary cultured sertoli cells and animal model, we will focus on the new role of NR6A1 in this project and explore the molecular mechanism of NR6A1 for regulating the function of the blood-testis barrier in mouse on molecular, celluar and whole body level, respectively. It will enhance our understanding on both the microenvironment of BTB and spermatogenesis disorder, and provide us important molecular targets for male infertility.

血睾屏障是以睾丸支持细胞及支持细胞与生精细胞间的连接为基础形成的结构，对其精细的调控是精子生成的保障。研究表明，TGFβ1是参与血睾屏障功能调节的重要细胞因子。在前期工作中，我们发现miR196a及其靶分子NR6A1能响应生殖细胞中TGFβ1信号的调节。进一步发现miR196a在生殖系统中特异性表达，并可能与睾丸支持细胞连接功能相关。在此基础上，我们推测：（1）在调节睾丸发育的TGFβ1信号通路中，存在TGFβ1-miR196a负调控NR6A1的作用途径；（2）NR6A1具有调节睾丸支持细胞间连接解聚的潜在作用。因此，本项目利用原代培养的小鼠支持细胞和小鼠血睾屏障损伤模型，以miR196a负调控NR6A1为切入点，从分子、细胞、整体水平等三个层次深入探讨NR6A1在调节支持细胞连接及血睾屏障功能中的作用及机制，明确和解析NR6A1的新功能，加深我们对精子发生微环境及精子发生障碍的了解。

精子发生是一个复杂的细胞分化过程，受遗传、内分泌、免疫、血睾屏障等多种因素的精细调节。基于前期工作基础，本项目提出的科学假说是：在调节睾丸发育以及细胞间连接的TGFβ1信号通路中，可能存在TGFβ1-miR196a负调控转录因子NR6A1的作用途径；以及NR6A1可能具有参与细胞间连接解聚的功能。根据研究计划，本项目主要开展了如下工作：（1）确定了miR196a-5p在小鼠雄性生殖细胞中扮演抑制子的角色，其主要发挥抑制细胞增殖和迁移的作用。（2）在结构与细胞功能上，明确了miR196a-5p对其靶基因NR6A1的识别与负调控。（3）阐明了NR6A1在生殖细胞连接功能中的作用及机制。发现NR6A1对细胞间的聚集与粘附发挥抑制作用，筛选了NR6A1作用的下游靶分子和互作蛋白，并最终确定NR6A1通过负调控连接蛋白E-cadherin在细胞连接中发挥功能。在机制上，阐明了NR6A1主要通过DR0位点识别以及招募DNA甲基化转移酶Dnmt1的方式来抑制E-cadherin的表达。（4）完成了NR6A1基因启动子的活性及转录调控分析，确定了转录因子Sp-1对NR6A1启动子转录活性的调控。（5）确定了miR196a-5p/NR6A1/E-cadherin在维持干细胞多能性以及抑制细胞分化过程中的作用。（6）在其他方面，本研究还开展了NR6A1在细胞代谢等方面的研究，初步确定NR6A1通过mTOR信号途径促进多种肿瘤细胞的糖酵解。综上，这些研究成果将加深我们对精子发生障碍的了解，拓展了对NR6A1功能的认识，为男性不育的诊治提供重要的分子靶点。在项目执行期间，本课题组以第一作者或通讯作者发表相关研究论文5篇（其中SCI论文1篇，其他论文4篇），正在投稿SCI论文2篇；培养研究生4人。