靶向PD-L1的肽适体筛选及其抗鼻咽癌的作用及分子机制研究

Nasopharyngeal carcinoma is one of the most common malignant tumors in south China, which is easy to relapse and metastasis. At present, the preferred treatment for nasopharyngeal cancer is radiotherapy, but the 5-year survival rate of radiotherapy alone is less than 60%, which also has great side effects on patients. Therefore, it is urgent to search for new highly effective and low-toxic rescue and treatment drugs. Recent studies have shown that PD-1/PD-L1 negatively regulates the immune response of T cells and plays an important role in tumor immune escape, but only a few studies have focused on the intrinsic signal pathway of PD-L1 in tumor cells, and its high expression can transmit an intrinsic pro-survival signal and promote the survival of tumor cells. Here, we hypothesizes that peptide aptamer targeted intervention of PD-L1 in nasopharyngeal carcinoma cells will affect the intrinsic signaling pathway of tumor cells, thus affecting the proliferation, migration and apoptosis of tumor cells. To prove this hypothesis, we using the human PD-L1 as target, screening the candidate peptide aptamer from the constructed peptide aptamer libray. Then we use the human nasopharyngeal carcinoma cell lines to investigate the effects of peptide aptamer intervention PD-L1 protein function, and analyze the effects of peptide aptamer on the proliferation, migration and apoptosis of tumor cells. And using the transcriptome method to analyze the gene expression changes of the tumor cells, focus on analysis of PI3K/Akt/mTOR signaling pathways, thereby illuminates the anti-tumor molecular mechanism of peptide aptamer, and provides experimental basis for the new strategy of prevention and treatment of nasopharyngeal carcinoma.

鼻咽癌是一种好发于我国南方的恶性肿瘤之一，易复发和转移。目前鼻咽癌治疗首选手段为放疗，但单纯放疗的5年生存率低于60%，对患者亦具较大副作用。因此迫切需要寻找新型高效低毒的解救治疗药物。近年研究表明，PD-1/PD-L1负调控T细胞免疫应答，在肿瘤免疫逃逸中发挥重要作用，但只有少数研究关注PD-L1在肿瘤细胞中的内在信号途径，其高表达可传递一种内在促生存信号，促进肿瘤细胞存活。在此我们提出假说，肽适体靶向干预鼻咽癌细胞PD-L1，影响肿瘤细胞内在信号途径，影响肿瘤细胞增殖、迁移及凋亡。为证明该假说，我们以人源PD-L1为靶标，从肽适体文库中筛选候选肽适体，利用人鼻咽癌细胞系探讨肽适体对PD-L1蛋白的影响，分析对肿瘤细胞增殖，迁移，凋亡的作用，转录组学分析肿瘤细胞内基因表达变化，重点分析PI3K/Akt/mTOR等信号通路，阐述肽适体抗肿瘤分子机制，为鼻咽癌防治新策略提供实验依据。

鼻咽癌是一种与EB病毒相关的恶性肿瘤，具有显著地理分布特点，好发于我国南方，易复发和转移。目前鼻咽癌治疗首选手段为放疗，但单纯放疗的5年生存率低于60%，对患者亦具较大副作用。因此迫切需要寻找新型高效低毒的解救治疗药物。在新型治疗剂的现有发展中，免疫检查点疗法已实现治疗复发性或转移性肿瘤的突破，近年研究表明，PD-1/PD-L1负调控T细胞免疫应答，在肿瘤免疫逃逸中发挥重要作用，但只有少数研究关注PD-L1在肿瘤细胞中的内在信号途径，其高表达可传递一种内在促生存信号，促进肿瘤细胞存活。本项目以鼻咽癌为研究对象，通过构建以人源硫氧还蛋白hTRX为骨架蛋白的肽适体文库，采用酵母双杂交筛选靶向结合PD-L1 IgV结构域的特异肽适体，并通过化学合成肽适体可变肽段，体外分析对鼻咽癌细胞增殖影响；将候选肽适体克隆构建到建哺乳动物表达载体上，采用脂质体转染的方法，转染到鼻咽癌细胞，观察对其增殖的影响；并进一步通过酵母双杂交验证，以及为了更好揭示相互作用机制，诱导表达人源硫氧还蛋白，制备多克隆抗体。结果表明，以hTRX为骨架蛋白的肽适体文库，其可变肽区由10个随机氨基酸组成，丰度高，满足筛库要求。酵母双杂交显示，hTRX无自我激活作用和无毒；人源PD-L1、PD-L1 IgV均无自我激活作用和无毒，且hTRX与PD-L1、PD-L1 IgV之间无相互作用。对第一轮靶向PD-L1 IgV的肽适体通过生物信息学预测后，化学合成7个肽适体中的可变肽段，结果显示pep-7能在胞外显著抑制鼻咽癌细胞增殖，将整个肽适体克隆构建到哺乳动物表达载体上，脂质体转染鼻咽癌细胞后，结果显示pep-6、pep-7组相比转染hTRX组显著抑制细胞增殖，与胞外结果一致，且再次通过酵母双杂交验证与PD-L1 IgV有较强地相互作用。为了更好揭示作用机制，可溶性地表达了人源硫氧还蛋白hTRX，并以之免疫白兔，制备了高效价、高纯度的多克隆抗体，为后续深入研究机理奠定了基础。本研究结果综合表明，靶向人源PD-L1 IgV的特异肽适体能在细胞内、外对其增殖产生显著抑制，可能特异肽适体靶向干扰了PD-L1功能，改变了其所调控的促进肿瘤细胞增殖的信号通路，发挥其抑制效应，目前我们正在通过全转录组和蛋白质组学深入地揭示其作用机制，并进一步证实特异肽适体与PD-L1 IgV的互作，为其进一步优化提供科研基础。