导电丝胶神经导管联合基因编辑技术的长距离外周神经再生新策略研究

Peripheral nerve transection is a common and disabling injury in clinical practice. Functional and structural recovery of transected peripheral nerves (particularly with large peripheral nerve defects) remains challenging.Tissue engineered nerve guidance conduitscan provide mechanical support and nerve-favorable microenvironment for bridging and guiding transected nerves’regeneration. However, the poorregenerative ability of peripheral nerves limits repairing efficacy. PTEN and SOCS3 are two key inhibitory moleculesinnerve regeneration, while electric stimulation is a strong exogenous signal for promoting nerve regeneration.Our data have shown that PTEN/SOCS3 silencing in conjunction with electric stimulation have significant synergistic effectsin enhancing nerveregeneration. In this project, we aim to fabricate a conductive sericin nerve guidance conduit to mediate electric stimulation to stimulate nerve regeneration. Meanwhile, we will employ dCas9-CRISPRi genome editing techniqueto silence the expression of PTEN and SOCS3 genes in order to release neurons’intrinsic regeneration capability. Thus, the combination of exogenous electric stimulation with intrinsic gene expression regulation would be expected to drastically promote peripheral nerve regeneration. We hope that the successful implementation of this project will offer a new strategy for effective repair of transected peripheral nerves.

外周神经离断是临床常见的致残性疾病。实现离断神经（尤其是长距离神经缺损）的功能和结构修复是世界性医学难题。优良的组织工程导管可提供良好的机械支持和微环境，桥联断端并引导神经再生，然而外周神经自身相对不足的再生能力限制了修复效果。PTEN和SOCS3是两个关键的神经再生内源性抑制分子；电刺激是促神经再生的强烈外源性信号。我们前期研究表明PTEN/SOCS3沉默和电刺激有明显的协同效应，显著促进神经再生。本项目拟合成一种导电丝胶神经导管，介导电刺激；同时运用dCas9-CRISPRi基因编辑技术高效沉默外周神经细胞内PTEN和SOCS3基因；以此将外源刺激激发出的再生能力与内源性释放出的再生能力巧妙结合，提高外周神经再生效率。本项目的成功实施将为外周神经损伤的组织工程修复提供新策略。

本团队选用高导电性的碳纳米管（CNTs）修饰天然丝胶生物材料，成功制备一种CNT-丝胶复合神经导管。该导管具有多孔微结构、生物相容性、温和的膨胀性能以及生物降解性。在大鼠坐骨神经离断模型中，CNTs-丝胶复合神经导管联合电刺激疗法成功修复10mm的坐骨神经缺损，组织学、电生理学和行为学等实验结果表明CNTs-丝胶复合神经导管联合电刺激疗法显著促进大鼠神经功能恢复。此外，本团队利用戊二醛化学交联丝胶，成功研发搭载氯倍他索的新型丝胶神经导管，实验结果显示戊二醛交联的丝胶生物材料显著上调施万细胞神经营养因子-3（NT-3）和神经营养因子-4（NT-4）的mRNA和蛋白水平，氯倍他索激活PI3K/Akt信号通路促进施万细胞增殖并上调髓鞘相关基因（NRG-1和EGR-2）的表达水平。在治疗10mm坐骨神经离断大鼠模型时，该导管显著促进髓鞘再生、神经轴突再生和神经功能恢复。在CNT-丝胶复合生物材料基础上，本团队深入研究并发现该复合生物材料具有记忆形变性能、可注射性和促干细胞向神经分化的特性。在大脑中动脉闭塞（MCAo）小鼠模型中，通过MRI扫描、3D重建、3D打印与倒模技术成功制备与梗死空洞相匹配的复合生物支架，脑内移植后其可恢复原有形状并与梗死空洞相匹配。在CRISPR基因编辑方面，本团队针对编辑蛋白失活导致的内源性基因单次编辑效率低下的问题，提出编辑蛋白和递送系统共催化的策略，运用有机化学和材料化学方法，设计合成新型金属有机框架材料（metal-organic framework, MOF），高效递送CRISPR编辑工具并辅助编辑蛋白切割DNA，达到对内源性基因VEGF和DNMT1高效编辑，并成功运用基于MOF的基因编辑方法进行疾病治疗。此外，本团队以丝胶生物材料为切入点，分别从丝胶的提取与生物活性、不同形式生物材料的制备、以及其在生物医学中的应用等方面进行系统性的工作总结。综上，本项目基于丝胶生物材料成功研发多款人工神经导管并提出具体的神经再生与修复策略，为人工神经导管研发与临床转化提供理论指导。