高温放线菌YT06二硫键还原酶和蛋白酶协同降解角蛋白机理研究

Intensive livestock farming development produced a large number of keratin waste. With the aggravating of the protein resource shortage and the economic development of China, the utilization of discarded keratin waste becomes more and more urgent. Microbial degradation and conversion of keratin has great ecological and economic potential benefits. However, so far the key factors of disulfide bond broken in the process of the microbial degradation of keratin are not yet clear, and the synergy mechanism of enzymes involved in the process of biochemistry and molecular biology of keratin degradation is without deep studies, which restrict the development of the application of microbial degradation. In previous study, Thermoactinomyces sp strain YT06 was screened from high temperature poultry compost as advantage in high efficiently conversion feather keratin into amino acids. The hydrolytic enzyme produced by the strain YT06 is thermostable and alkaline tolerant. The obtained results indicated that the single protease couldn’t lead to full keratin hydrolyzation. In this project, we will combine the transcriptome and secretome data analysis methods of the strain YT06 to identify the key disulfide reductase and protein enzymes genes involved in biodegradation of keratin. Genes cloning, heterologous expression and purification will be carried out to verify the function of the key enzymes. The synergistic effect of two kinds of enzyme on keratin degradation will be studied in order to clarify the mechanism of breakdown of keratin. In conclusion, our study will provide feasible theoretical basis and technical support for the high value utilization of keratin waste.

集约化养殖业发展产生了大量的角蛋白类废弃物，随着蛋白资源紧缺程度的加剧和我国经济的发展，亟需实现废弃角蛋白的转化利用。微生物降解转化具有巨大的生态效益和经济效益，但迄今关于微生物降解角蛋白过程中二硫键断裂的关键因子尚不明确，多酶协同的生物化学与分子生物学机制尚不明晰，制约了生物降解法的应用。YT06是本实验室分离自高温畜禽粪便堆肥具有高效降解羽毛角蛋白转化成游离氨基酸的高温放线菌，产生酶具有良好的热稳定性与耐碱性。前期试验发现除了丝氨酸蛋白酶还有其他因子参与角蛋白降解。本项目将结合转录组学及分泌蛋白组学数据，分析挖掘该菌株参与降解角蛋白关键二硫键还原酶类与蛋白酶类基因；通过基因克隆表达、酶的分离纯化等手段进一步验证关键酶的功能，揭示两类酶的不同组分在角蛋白降解过程的协同作用方式及效应，以期明确角蛋白微生物降解主要的生物化学过程，为废弃角蛋白的资源化高值化利用提供理论依据和技术支持。

项目申请人从畜禽粪便的高温堆肥中筛选到一株高效降解羽毛角蛋白的嗜热菌株高温放线菌Thermoactinomyces sp. YT06，产生的酶具有良好的热稳定性和耐碱性特点。前期研究发现单一的酶并不能完全高效的降解角蛋白，还有其他酶或协同因子参与，为了进一步阐明不同的酶在角蛋白降解过程中的相互作用关系，本项目结合转录组学及分泌蛋白组学数据，挖掘参与角蛋白降解的关键基因，通过对关键基因克隆表达，研究了蛋白酶和二硫键还原酶在角蛋白降解过程中协同促进关系。通过转录组和分泌蛋白组的分析挖掘到了和角蛋白酶降解相关的基因分别为蛋白酶基因（kerT1），二硫键还原酶硫氧还蛋白基因（Thioredoxin Trx1、Thioredoxin reductase TrxB、 Thiol-disulfide oxidoreductase CcdA）和胱硫醚合成酶基因（Cystathionine gamma-synthase MetB、Cystathionine beta-lyase MetC），利用大肠杆菌表达系统将上述基因进行异源表达，获得相关降解基因的重组蛋白。设计不同的酶组合研究其对角蛋白降解的影响发现，蛋白酶和二硫键还原酶或胱硫醚合成酶组合条件下角蛋白酶酶活都大于单一蛋白酶对底物的作用，其中kerT1与CcdA和 MetC的组合情况下，对角蛋白酶活性促进作用最明显，角蛋白酶活性提高158%。说明角蛋白降解过程中蛋白酶发挥着主要作用，氧化还原酶（Trx1、TrxB、 CcdA）促进了角蛋白二硫键的打开，胱硫醚合成酶（MetB、 MetC）是一种裂解酶，催化碳硫键的裂解，这两种酶的作用有利于二级结构的破坏，从而促进了蛋白酶与底物发生作用，加速了角蛋白的降解。本研究揭示了高温放线菌YT06在降解羽毛的过程中几种不同类型的酶相互协同促进加快角蛋白降解，本研究的结果为角蛋白降解机制的阐明提供了思路，为角蛋白废弃物进一步资源化利用提供了理论基础。