HINT1介导泛素/Skp2及Rac1调控人肝癌细胞NF-κB转录因子活性的作用机制研究

本项目对三组氨酸核苷结合蛋白1（HINT1）介导泛素SKP2及RAC1调控肝癌细胞NF-κB转录因子的机制进行研究：①HepG2细胞共转导Hint1、Rac1及Skp2，免疫荧光及免疫沉淀检测HINT1与RAC1、 SKP2结合；②Hint1或pGenesil-Hint1转导，检测IκBα、pIκBα及细胞质、核中p65表达；共转导HA-hint1, Flag-IκBα及myc-Ubiquitin，检测Flag-IκBα泛素化；NF-κB/Luc及pGenesil-Hint1转导，检测转录因子活性；③pGenesil-Hint1与Rac1共转导，检测JNK1/2及pJNK1/2表达；检测转录因子活性④检测临床标本中HINT1、Rac1、SKP2、NF-κB表达并研究其相关性。HINT1调控NF-κB转录因子的机制研究，目前尚无文献报道。本项目对研发肝癌诊断标记物及肝癌基因治疗等有重要意义。

发现新抑癌基因（Hint1）及其蛋白(HINT1)对肝细胞性肝癌的诊断和基因治疗有重要意义。本项目对组氨酸三聚体核苷结合蛋白1（HIT nucleotid binding protein-1，HINT1）的功能进行研究：①载体构建：构建HA标识Hint1基因；②体外实验：检测过表达外源HINT1对人肝癌细胞体外增殖的影响；通过western blot检测转染Hint1后的肝癌细胞中Rac1、SKP2、NF- κB、IκBα、SCFβ-TrCP、Girdin、Akt蛋白表达；检测干扰Hint1后的肝癌细胞中IκBα、Girdin蛋白表达；通过免疫荧光共聚焦检测HINT1与特定信号蛋白的共定位关系；通过免疫共沉淀实验检测HINT1与特定信号蛋白（SCFβ-TrCP、Girdin等）的相互作用关系；③临床相关实验：检测HINT1及相关蛋白激酶、转录因子在临床肝癌标本中表达。该项目居国际Hint1基因功能研究前沿。研究目标为证实HINT1抑制肝细胞性肝癌增殖并发现其抑癌的部分分子机制研究及信号传导途径。本研究对研发肝癌的早期诊断生物标志物及肝癌的基因治疗有重要意义。