唾液酸路易斯寡糖修饰血栓调节蛋白活性片段在靶向治疗血栓性疾病中的作用及机制研究

The effectiveness of the developed antithrombotic agents so far remains limited by systemic side effects, such as major bleeding complications. It has great significance to find safe and effective targeted agents. Thrombosis and inflammation are biologically inseparable processes. Inflammatory are capable of activating coagulation and inhibiting fibrinolysis, whereas the procoagulant thrombin is capable of stimulating multiple inflammatory pathways. Selectins as adhesion molecules expressed during endothelial activation can be the biomarkers of thrombosis. Sialyl lewis x (SLex) is the specific substrate of selectins. As a specific drug vehicle, we propose SLeX decorated TM through a polyethylene glycol（PEG）triazole structure termed as an inflammatory site-specific antithrombotic agent through the NF-κB signal pathway. Based on the preliminary study, in this project, we will synthetize a series ofrTM-PEG-（multi-）SLeX glycoprotein, test the anticoagulant activity ,site-specific property and mechanism, provide a rational design strategy for generating anticoagulant drugs.

由于严重的出血副作用，寻找安全有效的靶向性抗血栓药物具有重要的意义。炎症促进高凝状态，血栓又激活多种炎症途径，炎症部位高表达的选择素可作为血栓前状态及血栓形成的标志物。唾液酸路易斯寡糖（SLeX）是选择素的特异性底物，可以作为药物的特异性糖类载体发挥靶向作用。血栓调节蛋白（TM）可作用于多个环节发挥抗凝、纤溶、抗炎等功能。我们推测将重组血栓调节蛋白活性片段（rTM）和SLeX通过点击化学方法定点偶联，构建得到的rTM-PEG-（multi-）SLeX糖蛋白化合物可靶向定位于血栓形成部位，并通过调控NF-κB信号通路起到抗血栓作用。在已获得的rTM-N3及rTM-PEG500-SLeX基础上，本项目拟构建并优化筛选得到性质优良的rTM-PEG-（multi-）SLeX糖蛋白化合物，明确其靶向抗血栓作用及机制，从一个新的视角为血栓性疾病的靶向预防和治疗探索一条可行的研究策略。

我们推测将重组血栓调节蛋白活性片段（rTM）和SLeX通过点击化学方法定点偶联，构建得到的rTM-PEG-（multi-）SLeX糖蛋白化合物可靶向定位于血栓形成部位，并通过调控NF-κB信号通路起到抗血栓作用。课题组在研究中，以2-（N-叔丁基氧羰基氨基）-4-氨基丁酸为原料，经叠氮化反应合成蛋氨酸结构类似物-叠氮丁氨酸（2-氨基-4-叠氮基丁酸）。在缺乏蛋氨酸的培养基中加入叠氮丁氨酸，蛋氨酸缺陷型大肠杆菌 pGEX-5X-3/rTM/ B834(DE3)以其为原料合成蛋白，叠氮基团由此引入rTM中，得到抗凝活性片段rTM-N3，rTM-N3结构中包含EGF4-6区域和叠氮丁氨酸结构，继续通过点击化学方法与PEG1000-SLeX炔基衍生物反应，得到rTM-PEG1000-SLeX，通过血小板聚集等研究初步证明其具有体外抗凝作用。进一步研究发现，rTM-PEG1000-SLeX对LPS诱导的HUVEC凋亡具有抑制作用，并能够调控NF-κB炎症信号通路。