双营养因子缓释型轴向取向纳米纤维神经导管诱导长距离神经再生的研究

In this project a novel trophically and topographically functionalized silk-P(LLA-CL) nanofiber conduit has been developed for long gap(40mm) nerve regeneration. Natural polymer silk fibroin and synthesis polymer poly(L-lactide-co-e-caprolactone)（P(LLA-CL)） with different ratios will be blended and electrospun into nanofibers, The structure and properties of the nanofibers will be investigated, that include mechanical properties,biological properties and biodegradability. To achieve both better mechanical property and biocompatibility a special ratio of silk fibroin to P(LLA-CL) will be selected for nerve conduit fabrication. For the first time gangliosides M1(GM1) and nerve growth factor(NGF) will be electrosun together into core-shell nanofibers as the core part by co-axial electrospinning.The controlled release behavior of GM1 and NGF from nanofibers will be investigated.The released GM1 and NGF will be usd to culture with PC12 cells to evaluated their biological function, which can be confirmed by the neurite outgrowth. A new designed nanofiber conduit fabrication system will be used to fabricate the nerve conduit with fiber alignement along the tube axial direction. The fiber alignement suppose to guide the nerve regeneration. Finally the GM1/NGF controlled release aligned silk-P(LLA-CL) nanofiber conduits will be fabricated and used to bridge the 40mm sciatic nerve defect of dogs. At different time periods the regenerated nerve in the conduits will be used for electrophysiological evaluation, histological and histomorphometric analysis, immunohistological analysis. The project will investigate how neurotrophic factor and topographical structure promote the nerve regeneration.

课题从材料性能、生物化学和拓扑结构诱导三方面入手制备新型神经导管用于40mm长距离神经缺损的修复。制备丝素蛋白和P(LLA-CL)复合纳米纤维，通过其结构、力学性能、生物可降解性、生物安全性的检测筛选出既具有良好的力学性能又具有优良的生物相容性的最佳复合比的丝素-P(LLA-CL)纳米纤维用于神经导管的制备。首次将具有协同作用的营养因子GM1和NGF同轴共纺于纳米纤维的芯层，研究GM1和NGF的缓释行为及缓释动力学，用PC12 细胞与缓释液共培养以检测不同时间从纳米纤维中缓释的GM1和NGF的生物活性。创新性地推出轴向取向纳米纤维神经导管的机械化制备新工艺，制备出负载不同营养因子的轴向取向的新型神经导管并用于犬的坐骨神经的修复。通过电生理测定、组织学检测和免疫组织化学染色分析，检测再生神经的形态和功能。比较GM1和NGF以及纤维的取向因素对神经再生的诱导作用，揭示GM1和NGF的协同作用。

课题从材料性能、生物化学和拓扑结构诱导三方面入手制备双因子缓释型轴向取向纳米神经导管用于神经缺损的修复。制备丝素蛋白(SF)和聚乳酸己内酯共聚物(PLCL)复合纳米纤维，通过其结构、力学性能、生物可降解性、生物安全性的检测筛选出既具有良好的力学性能又具有优良的生物相容性的最佳复合比的PLCL/SF纳米纤维用于神经导管的制备。该研究首次将具有协同作用的营养因子GM1和NGF同轴共纺于纳米纤维的芯层，研究GM1和NGF的缓释行为及缓释动力学，用PC12细胞与缓释液共培养以检测不同时间从纳米纤维中缓释的GM1和NGF的生物活性。研究结果表面GM1和NGF均能很好地从纳米纤维中缓释出来并且保持其生物活性。体外生物相容性检测表面能够缓释双因子的纳米纤维支架能够更好的促进雪旺细胞和PC12细胞增殖，此外双因子的协同作用亦能很好地诱导PC12细胞分化。建立新西兰兔坐骨神经缺损模型后，将该支架植入后分别于9个月和14个月后进行检测，HE染色，甲苯胺蓝染色以及透射电镜结果表明负载双因子的纳米纤维支架能够更好的促进新西兰兔坐骨神经再生和功能的恢复。.其次，因为近年来研究发现，外加电刺激可以很好的促进神经细胞的粘附并且引导神经轴突的延伸，具有导电性能神经组织工程支架的研究得到了研究者的广泛关注。因此，本研究创新的将导电高分子材料聚苯胺（PANi）和聚吡咯（Ppy）研究相互结合，制备导电神经导管支架以期应用于神经修复。其一，一方面PANi被掺杂到PLCL/SF体系中进行静电纺丝得到具有高且稳定导电性的纳米纤维支架，另一方面NGF以同轴静电纺丝的方法被包裹在纳米纤维内，体外缓释实验表明NGF能够很好地缓释且电刺激条件下能够一定程度上促进NGF的缓释。体外细胞实验表明该支架具有较好的生物相容性，电刺激条件下能够更好的诱导PC12细胞分化；其二，Ppy被以原位氧化聚合的方法附着在PLCL/SF纳米纤维表面，使得其导电其具有更好的亲水性能，体外实验也表明了该支架具有较好的生物相容性，结合电刺激实验发现该支架能够在没有NGF诱导而促进雪旺细胞增殖与分化。这两种研究均表明导电材料结合电刺激在神经修复上具有较好的应用前景。