基于功能性核酸的荧光各向异性传感之基础与应用

Fluorescence anisotropy (also fluorescence polarization) sensing based on functional nucleic acids conducts measurements in a homogeneous analysis manner with high-throughput and in situ analysis capacity, as well as low-cost, sensitive and selective properties, providing a powerful tool for the nucleic acid-target interaction study, drug discovery, biochemical research, clinical diagnosis, and food analysis. Thus, fluorescence anisotropy based on recognition between the functional nucleic acid and the target has attracted great attention and become an important area in the fluorescence biosensing field. This project will focus on basic questions arising from fluorescence anisotropy sensing based on functional nucleic acids, i.e. the physical model for describing rotational diffusion manner of DNA with different structures，the interaction between DNA and the fluorescent label, and the parameters that can be used to modulate fluorescence anisotropy. We hope to expand the application of the Perrin equation in predicting fluorescence anisotropy of fluorescently labeled DNA and to better apply this technique to development of generalizable, simple, and cost-effective sensing platforms, especially for small molecules which have been a challenge in the fluorescence anisotropy sensing field.

荧光各向异性（荧光偏振）信号受外界干扰波动小，可实现均相、原位分析。人工合成的功能性核酸既拓宽了生物识别的目标物范围，降低了成本，又使得传感方法简单、易于操作。基于功能性核酸的荧光各向异性传感能够将两者的优势有效的结合，构筑均相、原位、实时、经济、选择性好和灵敏度高的检测方法；由于荧光各向异性测量能提供研究体系丰富的信息，因此也为DNA与兴趣目标物之间的作用研究提供了有力工具，是荧光传感领域的重要方向之一。本项目拟围绕基于功能性核酸的荧光各向异性传感所涉及的基本科学问题开展系统研究，探讨不同结构的DNA转动扩散模式以及荧光团与DNA的相互作用，确定可调控荧光各向异性的参数，拓展Perrin 模型的应用，丰富与发展基于荧光标记核酸的荧光各向异性理论与方法，并在此基础上解决传统各向异性方法对小分子兴趣目标物灵敏度低等问题，构建通用、快速、简单的基于功能性核酸的荧光各向异性传感平台。

本项目围绕基于功能性核酸的荧光各向异性传感所涉及的基本科学问题开展系统研究，探讨荧光标记的不同结构长度的单双链DNA的荧光各向异性，得到了以下有意义的结论：（1）当DNA双链大于20 bp时，荧光各向异性偏离基于圆柱体模型的Perrin 理论预测值，不再随DNA的长度增加而增加。在不同温度、不同荧光染料标记的情形下结论相同。（2）不同荧光团、以及所处形成的双链不同的位置也对dsDNA响应长度有一定影响，都存在dsDNA达到一定长度后，各向异性信号拉平的现象。中间标记的dsDNA的响应长度响应增加，接近40 bp。（2）当在荧光探针一端为粘性端时，对荧光各向异性有较大影响，可以通过调节粘性链部分的长度实现对DNA荧光各向异性的调控，其粘性段与荧光团的相互作用以及对荧光各向异性的调控机理通过2D 1H-1H NOESY进行了解释。基于上述研究结论构建了基于DNA识别的荧光各向异性传感平台，实现了对DNA、蛋白质尤其小分子的分析。该研究结果为通用型的基于DNA识别的荧光各向异性传感策略的提供了理论指导，尤其解决了基于核酸适配体荧光各向异性法测定小分子时由于结合常数小而产生的灵敏度问题，对于小分子的检测尤其具有重要意义。.在本项目执行期间，同时也开展了基于纳米发光颗粒显微成像计数的方法学研究，构建金纳米颗粒暗场散射成像计数平台，以及多目标物荧光显微成像计数平台，并实现了单目标和多目标DNA、miRNA的测定，以及低丰度单碱基突变的测定。同时，对DNA为模板制备贵金属纳米簇的方法与发光机理进行了探讨。