Rab13 GTPase对血睾屏障紧密连接的调节

血睾屏障紧密连接的有序开放/关闭在精子发生过程中发挥重要作用，但具体机制还未明确。调节上皮屏障细胞连接的因素有很多，其中Rab GTPase家族已被证明参与一些上皮细胞连接复合体的功能变化。本研究以大鼠生精上皮为研究对象，在检测Rab13在睾丸中的表达分布及其与生精上皮周期的关系的研究基础上，首先建立睾丸支持细胞紧密连接的体外模型，使用siRNA技术沉默Rab13基因，或将不同活性的Rab13突变体转入体外培养细胞，并引入PKA活性的干预因素，以检测Rab13的表达、活性及Rab13-PKA通路对血睾屏障开关、紧密连接复合体动力学变化和损伤后修复等过程的调节作用；在此基础上，在大鼠体内验证这些作用，进一步探讨Rab13-PKA通路对血睾屏障紧密连接复合体动力学变化的调节机制。本研究期待为血睾屏障紧密连接复合体动力学变化和精子发生过程的分子机制研究提供新的思路及有价值的实验依据。

哺乳动物血睾屏障（BTB）存在于生精上皮近基底处，由Sertoli细胞（SC）间连接结构构成，为精子发生提供独立的微环境。然而在生精上皮周期中，BTB需经历重建过程以促进前细线期精母细胞的通过，这必然涉及SC间连接复合体的动态变化。基于Rab GTPase在调节胞内蛋白转运发挥的作用及本实验室前期研究结果，我们首先采用原代培养的大鼠SC，建立体外BTB模型，发现Rab13的表达随体外BTB屏障功能的建立逐渐下降，并验证了Rab13与PKA催化亚基间的直接作用；随后在睾酮增强SC模型中发现Rab13的表达亦有下调，并伴有PKA活性升高，且PKA抑制剂H89可拮抗睾酮增强BTB屏障功能的作用；在培养SC中转染siRNA沉默Rab13，可引起PKA活性升高，同时跨上皮电阻测定结果表明SC屏障功能增强，形态学及免疫共沉淀结果表明Rab13沉默可通过改变occludin和F-actin在SC连接处的分布及occludin与ZO-1之间的相互作用增强BTB功能，而H89可拮抗上述作用。在此基础上，我们进一步在大鼠体内验证Rab13对BTB功能的调节，通过在大鼠睾丸内注射转染Rab13 shRNA使局部Rab13表达沉默，发现睾丸组织裂解液PKA活性升高，组织荧光染色表明Rab13沉默可引起F-actin在BTB处集中分布且可影响occludin在生精上皮的表达规律，即VIII其生精上皮中occludin在BTB的分布显著增多。结合体内、外研究结果，本项目证明了Rab13通过影响PKA活性调节大鼠生精上皮中occludin、F-actin骨架的分布及紧密连接的组装，进而调节BTB的动态变化和精子发生过程。