定点突变对酶功能影响的分析算法研究

Site-directed mutagenesis is an important way to improve the function of an enzyme. In general, the functional alteration of a particular enzyme is achieved by a combinatorial site-directed mutagenesis of different sites. As an enzyme may have multiple active sites located in different positions and a number of different site-directed mutageneses at each active site could be possible, it is neither possible nor necessary to study all the possible combinatorial site-directed mutageneses of different sites in experiment. A promising way is to actualize saturation mutagenesis at some typical active sites, then by their proper combinations the property of a combinatorial site-directed mutagenesis is predicted and used to guide the site-directed enzyme design. Type III polyketide synthase (PKS) is a key enzyme involved in the biosynthesis of polyketide, and has long been used as models to investigate the relationship between the structure and function, and the structure-based molecular alterations of enzymes. The main objective of this project is to explore and establish effective algorithms to analyze the effects of combinatorial site-directed mutageneses on enzyme function of type III PKS from Polygonum cuspidatum. The project is of significance in systematically describing the function of specific amino acid residues, revealing the catalytic mechanism, exploring the structure-function relationships, as well as in site- directed-altering the functions of type III PKS. In addition, the methods and results of the project could also be of useful reference to the study of the relationship between the structure and function of other enzymes.

定点突变是改变酶功能的重要途径。一种特定的酶功能的改变一般需要通过不同位点的组合突变来实现。一种酶可能具有多个分布于不同位置的活性位点，每个活性位点又有多种突变方式，所以在实验中，不可能对所有不同位点的组合突变均进行实验。一种可行的途径是对一些典型的活性位点进行饱和突变，然后通过模型来预测不同位点组合突变时的功能，为设计酶的特定功能提供理论指导。III型聚酮合酶（PKS）是催化聚酮化合物生物合成的关键酶，是研究蛋白质结构与功能的关系、基于结构进行分子改造的重要模式系统。本项目拟以虎杖等植物III型PKS为研究对象，以期建立一套适合III型PKS的位点突变组合对酶功能影响的分析算法。本项目对系统描绘III型PKS特定位点氨基酸残基的功能，揭示其催化机制、探究其结构与功能关系及对III型PKS的定向改造都具有重要意义。同时，本项目的方法和结果对其它酶结构与功能关系的研究也具有重要的参考价值。

定点突变是改变酶功能的重要途径。一种特定的酶功能的改变一般需要通过不同位点的组合突变来实现。一种酶可能具有多个分布于不同位置的活性位点，每个活性位点又有多种突变方式，所以在实验中，不可能对所有不同位点的组合突变均进行实验。一种可行的途径是对一些典型的活性位点进行定点突变，然后通过模型来预测不同位点组合突变时的功能。植物Ⅲ型聚酮合酶（polyketide synthases，PKSs）是催化聚酮化合物合成的关键酶，是研究蛋白质结构与功能的关系、基于结构进行分子改造的重要模式系统。本项目以虎杖的III型PKS为研究对象，旨在建立一套适合III型PKS的位点突变组合对酶功能影响的分析算法。主要研究内容包括：1）分离虎杖的III型聚酮合酶基因，并通过体外酶促反应研究其功能；2）通过定点突变研究其结构与功能的关系；3）基于定点突变的酶功能设计的组合优化算法研究。项目所获得的主要结果：1)从虎杖中分离到一个III型聚酮合酶基因，命名为PcCHS1。系统进化分析与体外功能研究表明，PcCHS1是一个典型的查尔酮合酶。同源建模结果表明，PcCHS1与紫花苜蓿中已解析晶体结构的MsCHS具有非常相似的三维结构和催化腔体；2）对PcCHS1的一系列定点突变研究表明，一些位于非活性位点甚至处在蛋白表面的氨基酸残基，不仅具有维持蛋白结构的作用，还能直接参与对酶活性的调控；3）针对基于定点突变的酶功能设计的组合优化问题，利用模拟退火算法和遗传算法对这类组合优化问题进行了近似求解。仿真实验结果表明，遗传算法在求解该问题时具有更优越的性能。本研究表明，一些位于非活性位点甚至处在蛋白表面的氨基酸残基，也可能对III型PKS的结构与催化活性产生直接的影响，这对探究III型PKS结构与功能关系及对其定向改造都具有重要意义，也为研究其他酶的结构与功能的关系提供了重要参考。