GDP-甘露糖-4,6-脱水酶通过调节EGFR岩藻糖基化影响非小细胞肺癌的发生发展

There are therapeutic difficulties in non-small-cell lung cancer(NSCLC) because of the classical characteristic（grow fast and badprogress）disease. Glycosylation plays a key role in the development and progress of tumors. Epidermal growth factor receptor(EGFR) is an very popular therapeutic targets in non-small-cell lung cancer(NSCLC). Data mining from TCGA indicated that expression level of GMDS (GDP-mannose-4,6-dehydratase), key enzyme of Fucose metabolism, in tumor tissue is about 8 times of that in adjacent tissues. Preliminary study showed that abnormal high expression of GMDS might regulate cell cycle, promote apoptosis-resistance and proliferation via promote fucosylation of EGFR. This project plan to enlarge the number of clinical samples to analyze the correlation of GMDS with the development and progress of NSCLC. We also plan to study the influence of GMDS on fucosylation, especially EGFR fucosylation level and kinase activity, malignant phenotypes of NSCLC by down-regulation of GMDS in high GMDS-expression NSCLC cell lines and up-regulation of GMDS in low GMDS-expression NSCLC cell lines. Microarray and glycomics method will be used to explore the downstream responding gene and binding protein of GMDS-EGFR fucosylation signal pathway. This research data will provide new sight to find new therapy method for NSCLC.

非小细胞肺癌的预后差和发展快的特点使其成为肺癌治疗中的一个难点。糖基化在肿瘤的发生和发展中起着非常关键的作用。表皮生长因子受体（EGFR）是非小细胞肺癌（NSCLC）的重要治疗靶标。我们采用生物信息学的方法从癌症和肿瘤基因图谱（TCGA，The Cancer Genome Atlas）的NSCLC数据库中挖掘发现，与癌旁组织相比，岩藻糖代谢关键酶GDP-甘露糖-4,6-脱水酶（GMDS）在NSCLC患者的肿瘤样本中的表达量大约是癌旁组织的8倍。初步研究发现，异常高表达的GMDS可能通过促进EGFR的岩藻糖基化进而调控细胞周期、抵抗凋亡，促进癌细胞的恶性增殖。本课题拟扩大临床样本数目分析阐明GMDS在NSCLC发生发展的调控机制；进一步深入研究GMDS对NSCLC细胞EGFR的岩藻糖基化水平及其活性，以及对肿瘤细胞多种恶性表型的影响。本研究成果将为寻找非小细胞肺癌治疗的新手段提供理论依据。

我们从TCGA（The Cancer Genome Atlas）癌症和肿瘤基因图谱计划数据库中下载肺腺癌（Lung adenocarcinoma, LUAD）成对RNA序列数据进行表达谱分析。通过应用基因组分析技术大规模基因组测序，将人类全部癌症（50种肿瘤)的基因组变异图谱绘制出来，并进行系统分析所有致癌和抑癌基因的微小变异。TCGA肿瘤数据表达量分析，我们选取RNAseq以及RNAseqV2的成对样本数据进行分析。TCGA数据库现存肺腺癌（LUAD）504个样本其中RNAseq有成对样本数据共57个，我们的表达谱分析就基于这些成对样本RNAseq数据。通过数据数据下载与拆分、过滤与标准化以及质量控制，计算得到肺腺癌中高表达的基因。GMDS是其中差异最显著的基因之一,癌组织中GMDS的表达量大约是癌旁组织的8倍。1）进而从临床样本、细胞实验和动物实验等方面，且从功能上阐明GMDS高表达对非小细胞肺癌肿瘤发生发展的作用。已完成以下几步：A选择1-2株高表达GMDS的非小细胞肺癌细胞株，进行RNAi干扰实验，检测到GMDS对非小细胞肺癌细胞各种生理功能的影响。选择常用的非小细胞肺癌细胞系1-2株，使用慢病毒介导的RNAi对GMDS基因进行沉默。检测基因沉默后细胞的岩藻糖基化情况，特别检测EGFR的糖基化情况。采用基于质谱技术的糖蛋白组学方法检测GMDS被干扰后，下游蛋白质糖基化的变化。并从细胞增殖速度（cellomics细胞计数），细胞周期分布（PI染色后FACS分析），细胞凋亡情况（Annexin Ⅴ染色后FACS分析），克隆形成，细胞迁移和侵袭能力（划痕实验，transwell）等方面进一步检测GMDS和岩藻糖基化对细胞增殖、细胞周期、凋亡和迁移侵袭的影响。选择1株低表达GMDS的非小细胞肺癌细胞株，进行GMDS过表达，检测GMDS对非小细胞肺癌细胞各种功能的影响。且选择低表达GMDS的非小细胞肺癌细胞系1株，使用慢病毒介导的过表达体系对GMDS基因进行过表达。从岩藻糖基化水平、特别是EGFR糖基化水平、细胞增殖速度阐明作用机制。