植物内源气体信号分子的原位实时检测新方法及其在非生物胁迫应答中的应用

As gasotransmitters, nitric oxide and hydrogen sulfide have a wide distribution and biological effects in plants, and are involved in the regulation of plant development and stress responses along with phytohormones. Due to the lack of direct and effective analytical methods for endogenous gasotransmitters in plants, most of the relevant researches are merely phenomenon descriptions, and the profound study of their effects and mechanisms has many limitations. In this project, we attempt to design and synthesize new fluorescent probes for hydrogen sulfide suitable for plant samples. In combination with the nitric oxide fluorescent probes available in our group, endogenous hydrogen sulfide / nitric oxide in plants will be captured rapidly and labeled fluorescently. And, the in-situ and real time fluorescence imaging and high performance liquid chromatographic quantification methods will be realized. Based on these researches, the variation and distribution of hydrogen sulfide / nitric oxide in Arabidopsis and rice under abiotic stresses will be investigated, and the synergy of hydrogen sulfide, nitric oxide and other phytohormones under abiotic stresses will also be explored. The expected accomplishment of this project will provide the technological platform for the direct detection of endogenous hydrogen sulfide / nitric oxide and the actual data of hydrogen sulfide / nitric oxide in signal transduction and mechanism, which will be helpful to revealing the physiological effects of gasotransmitters in the development and stress responses of plants and deepening the understanding into the roles of gasotransmitters in the regulation network of plants.

气体信号分子一氧化氮（NO）和硫化氢在植物体中具有广泛的分布和生物学效应，并与传统植物激素协同作用，参与植物体生长发育过程和逆境应答的调控。由于缺乏直接有效的植物内源气体信号分子的分析方法，相关研究大多为现象描述，限制了其生理作用和机理的深入研究。本项目拟设计合成适于植物内源硫化氢检测的新荧光探针，结合申请者已合成的NO荧光探针，对植物内源硫化氢/NO进行捕集和荧光标记，实现硫化氢/NO的原位实时荧光成像，并以高效液相色谱准确定量。在此基础上，考察拟南芥、水稻等模式植物在非生物胁迫下硫化氢/NO的含量及分布变化，并探讨此过程中硫化氢、NO和传统植物激素的协同调控作用。本项目将为内源硫化氢/NO在植物体内的信号转导、生理功能和深层次作用机理等研究提供技术平台，有助于完整全面地揭示气体信号分子在植物生长、抗逆等过程中的生理效应，加深对气体信号分子在分子调控网络中的作用和地位的理解与认识。

气体信号分子如一氧化氮（NO）、硫化氢和一氧化碳（CO）广泛参与调节植物生长发育的各个过程，是激素和信号转导的热点研究方向。但适于植物内源气体信号分子直接检测的方法却十分匮乏，相关研究数据主要来源于供体、清除剂等外源处理，极大限制了对内源气体信号分子在植物体内重要生理作用和机制研究。针对以上现状及植物生长需要光照的特点，本项目选用具有优异光稳定性的BODIPY、萘酰亚胺、香豆素为荧光团，通过构效分析，设计合成了一系列适用于植物的新型气体信号分子荧光探针，对内源NO、硫化氢、CO等进行原位实时荧光成像。并以拟南芥为模式植物，考察其在非生物胁迫下气体信号分子的含量及分布变化。主要研究内容和结果概括如下：. 1、构建了基于BODIPY荧光探针的NO荧光成像法和检测单细胞胞内外NO释放的定量分析方法。新turn-on型探针DMOPB激发/发射波长为574/622 nm，已避开叶绿素的主要吸收区域，且Stokes位移达48 nm，检测限低至1.0 nM。集进样-双标记衍生-分离-检测为一体的CE-LIF单细胞分析，细胞内外NO的检测限分别达2.4 amol和8.1 amol。. 2、基于新型硫化氢荧光探针DMONPB、TMSDNPOB、ASNHN-N3和荧光硅点SiND-ANPA-N3，发展了多种用于细胞和动植物组织中内源硫化氢的单光子/双光子荧光成像法和硫化氢胞外释放荧光观测方法。方法均可有效避免叶绿素和色素的干扰，尤其是利用ASNHN-N3、SiND-ANPA-N3建立的双光子成像法（激发波长840 nm，发射波长545 nm）。. 3、设计合成的香豆素类CO荧光探针Cou-CO克服了现有CO探针易被生物体中酯酶水解的缺点，灵敏度高，准确性好，并已用于细胞中内源和外源CO的荧光成像。. 4、将所合成的荧光探针和建立的方法用于植物在盐胁迫、干旱胁迫、高温与低温胁迫下气体信号分子的调控作用研究。