生物体系中一氧化氮高效分离检测与三维成像新方法及其作用机制的基础研究

一氧化氮（NO）在人和动物的各个生理系统中发挥着不可替代的作用，影响着植物的生长、发育和防御。由于有效直接检测NO分析方法的匮乏，生物体内NO的生理功能研究受到极大限制。本项目拟研究生物体系中NO的高效分离检测与三维成像新方法，从荧光探针入手，设计合成新型的以BODIPY为母体的芳香邻二氨类近红外荧光分子探针捕获NO；结合毛细管分子印迹整体柱固相微萃取技术对复杂生物样品进行预处理，建立衍生－毛细管固相微萃取－HPLC-荧光/CE-LIF法高灵敏直接检测生物体系中微量NO的新方法；建立生物组织连续切片成像、三维重建技术监测NO在较大块生物组织中三维分布的新方法。在此基础上，观察大白鼠在脑缺血过程中、水生植物在抗逆过程中NO的变化情况，推测其可能的作用机制。项目的完成将为生物体系中NO的直接检测提供技术平台，为从组织层面研究NO的存在和作用机制提供直观材料，以完整全面地揭示NO的生理病理功能。

一氧化氮（NO）在人和动物的各个生理系统中发挥着不可替代的作用，影响着植物的生长、发育和防御。由于有效直接检测NO 分析方法的匮乏，生物体内NO 的生理功能研究受到极大限制。本项目以新型长波长BODIPY荧光探针对NO的捕集为基础，研究生物体系中NO 的高效分离检测与荧光成像新方法。主要进展和成果概括如下：. 1、设计合成了适用于NO分析和成像的6种脂溶性近红外BODIPY荧光探针和1种水溶性最好的NO绿色荧光探针。其中，更大刚性结构的近红外DANPBOs探针与NO反应后，荧光强度增加了400倍以上，与可见光区NO荧光探针中最灵敏的DAMBO相当；在激光照射下，其NO衍生产物的荧光强度在2 h内基本不变，光稳定性可与量子点相媲美。具有可自由旋转双苯基结构的近红外MOPBs探针，Stokes位移均达38 nm，是DAMBO的4倍，克服了荧光自熄和杂散光干扰。而具有硼氧结构的BOPB探针，发射波长红移至643 nm的同时，其衍生产物仍有高荧光量子产率（0.21）和大Stokes位移（21 nm）。这些探针发射波长长、与NO反应后荧光增强倍数高、Stokes位移大、光稳定性强，有效解决了困扰NO成像和分析灵敏度的关键问题。. 2、利用上述荧光探针，实现了动植物组织和细胞中NO的成像分析。DANPBOs及其衍生产物在细胞内的保留超过3.5 h，明显优于商用NO荧光探针；基于DANPBOs，实现了肝损伤小鼠肝脏和水稻根部组织的NO成像，并用于水稻根部NO在外界胁迫下变化情况的研究。利用探针MOPBs和BOPB，可清晰显示LPS和IFN-γ激活的RAW 264.7巨噬细胞所释放的NO；水溶性TMDSDAB可直观展现吞噬鸡红细胞过程中，巨噬细胞的NO释放，开辟了水溶性荧光探针应用的新领域，为研究巨噬细胞免疫过程机理研究提供了强有力的可视化技术。. 3、建立了基于上述荧光探针结合整体柱富集分离的高灵敏、高选择性NO分析方法，实现了单个巨噬细胞胞内、胞外NO释放的同时测定，为NO的主动释放机制提供了直接证据。基于离子液体基团与NO衍生产物间的诱导作用及π-π共轭作用所制备的离子液体整体柱，能有效提高对NO衍生产物的富集效率，提高生物体系中NO的检测灵敏度。