卡氏枝孢霉皮肤感染时组织内硬壳细胞形成机制和致病性研究

着色芽生菌病是一种慢性皮肤及皮下的真菌感染性疾病，可致患者肢体功能残障甚至癌变，治疗困难，危害较大。卡氏枝孢霉是主要致病菌之一，而硬壳细胞是该菌在宿主体内的主要病原形式，对人体免疫防御系统的攻击和抗真菌药物均具有较强抵抗力。如何彻底清除组织内的硬壳细胞一直是该病治疗中的难题，而缺乏对硬壳细胞形成机制的了解是阻碍对其生成进行干预的主要原因。本课题拟在前期研究工作基础上，利用免疫组织化学、PCR及免疫印迹、蛋白质提取、质谱分析、RNA干扰等系列方法，分别在体外和体内实验中，研究硬壳细胞的形成与血小板活化因子（PAF）的关系以及PAF与宿主TH1/TH2细胞免疫的相互关系，并进一步从基因和蛋白质水平探讨PAF刺激效应通过何种信号传导途径参与硬壳细胞形成的分子机制。本研究一方面有助于了解硬壳细胞的致病机制，另一方面也可为清除硬壳细胞进而有效治疗着色芽生菌病提供新的思路。

卡氏枝孢霉侵入人体以后转变成棕色厚壁的硬壳细胞，不仅对现有的药物不甚敏感，而且对人体免疫防御系统的攻击具有较强抵抗力,引起着色芽生菌病的反复发作。本研究利用血小板活化因子（PAF）在体外培养中成功诱导卡氏枝孢霉孢子转化成具有典型结构成分的硬壳细胞，并利用荧光标记的法观察到，在胞浆和细胞膜中均有相关蛋白的存在。通过Western blot发现在卡氏枝孢霉孢子的全蛋白提取物中存在一个分子量约为38KDa的类PAF受体，对该蛋白序列进行质谱分析后，结果显示所获得的2段氨基酸序列均与乙醇脱氢酶的氨基酸序列的相似度为100%。初步推测，卡氏枝孢霉存在类PAF受体，且该未知基因可能与乙醇脱氢酶的相似度更高，或者乙醇脱氢酶存在与PAF类受体相似的功能。利用卡氏枝孢霉感染的动物实验和免疫组化法，发现免疫正常组在感染早期PAF表达水平显著高于感染后期(硬壳细胞形成期)；免疫抑制组感染后期PAF的表达水平较早期显著增高。说明卡氏枝孢霉作为一种刺激因子可以刺激PAF合成和分泌，随时间延长PAF被分解而降低。上述结果证明PAF作为体内的一种具有多种生物学活性的内源性磷脂递质确实通过结合其孢子上的类PAF受体参与了卡氏枝孢霉硬壳细胞的转化，这有助于我们深刻了硬壳细胞的形成及致病机理。