超微量赤霉素类植物激素测定新方法及其在拟南芥突变体研究中的应用

赤霉素类（GAs）植物激素在已公认的5种植物内源激素中种类最多、生理功能最广，其种类、数量和状态会随植物发育的进程而改变，且主要农作物的"绿色革命"都与赤霉素密切相关，实现GAs的超微定量分析意义重大。本项目拟以GAs植物激素为检测对象，设计合成新型高灵敏的以哌嗪、肼为反应基团具有长波长的BODIPY类荧光分子探针，对超微量GAs进行标记；以分子印迹技术制备GAs专属性固相微萃取整体柱，对GAs选择性富集；建立微量样品中超微量GAs植物激素分子印迹毛细管固相微萃取－衍生－高效液相色谱-荧光/毛细管电泳-激光诱导荧光检测的新分析方法，监测拟南芥及其突变体在不同生长时期GAs活性形式和含量的变化情况，探索利用GAs植物激素活性形式和含量变化初筛突变体的可能性。本项目将促进基于荧光探针的植物激素分析方法的发展，为GAs植物激素的检测提供技术平台，为植物激素生理研究提供实验资料和检测手段。

赤霉素类（GAs）植物激素在已公认的5种植物内源激素中种类最多、生理功能最广，其种类、数量和状态会随植物发育的进程而改变，且主要农作物的“绿色革命”都与GAs密切相关，实现GAs的超微定量分析意义重大。GAs的测定尤其是超微量测定一直是植物激素分析的难题，主要原因是其种类多、结构极其相似，且没有可供灵敏检测的信号。本项目执行前，只有基于质谱的色谱/毛细管电泳联用技术能实现多种GAs的同时定量分析，但高昂的费用使之在实际样品分析中受到一定限制。本项目以高灵敏的BODIPY荧光探针，标记GAs植物激素，结合毛细管固相微萃取，建立微量样品中超微量GAs的高效液相色谱-荧光（HPLC-FD）/毛细管电泳-激光诱导荧光（CE-LIF）检测的新分析方法。主要研究内容和结果概括如下：.1、设计并筛选出适于HPLC-FD/CE-LIF分析的新型BODIPY荧光探针TMBB-P和TMBB-EDAN，其激发/发射波长分别为493/506 nm和495/505 nm，荧光量子产率为0.93和0.70，光稳定性好，可室温不避光保存。TMBB-P与羧酸化合物衍生时副反应较少，分离时谱图中杂峰少；而TMBB-EDAN的反应活性强，与羧酸化合物的反应室温即可完成且所需时间较短。.2、利用合成的荧光探针，建立了柱前衍生－HPLC-FD/CE-LIF分析GAs植物激素的高灵敏、低成本的选择性新方法，并用于拟南芥等植物样品分析。对基质相对简单、样品量为0.5-1 g左右（鲜重）的植物样品，简单溶剂萃取后即可进行测定。HPLC-FD法的检测限最低可达0.08 nM，CE-LIF法可达0.04 nM。CE-LIF法与基于质谱的毛细管电泳分析GAs方法相比，灵敏度至少提高16倍，测定的样品更复杂，且不需固相萃取。建立的方法在GAs等羧酸类植物激素的实际样品常规分析中具有特殊优势。.3、在对以GA3为模板分子的分子印迹毛细管固相微萃取性能考察评价的基础上，发展了毛细管聚合物整体柱固相微萃取GAs等羧酸类植物激素的富集方法，富集倍数约为10，结合柱前衍生－HPLC-FD/CE-LIF测定，可使样品量进一步减少。.4、一氧化氮（NO）是植物体中的气体信号分子，生理作用与植物激素密切相关，我们对此进行了扩展研究。设计了两种性能优异的长波长BODIPY荧光探针，并用于植物中NO及其与赤霉素等植物激素的关系研究。