锌指核酸酶定点突变转基因山羊外源性GFP基因的研究

本项目以F1代转GFP基因山羊胎儿成纤维细胞为研究对象，基于人工锌指核酸酶基因打靶理论，通过对转染细胞中外源GFP基因靶向序列分析、突变事件发生和细胞表达绿色荧光的比例以及强度的变化，探讨人工锌指核酸酶介导山羊胎儿成纤维细胞中外源基因靶向修饰的可能性，并揭示靶向序列发生修饰的方式和效率，同时结合细胞稀释法获得GFP突变型单克隆细胞株；分别以GFP突变型细胞和正常细胞为供核细胞构建重构胚，比较二者在各期胚胎发育率上的差异，并获得GFP突变型转基因克隆山羊，以探讨人工锌指核酸酶介导基因靶向修饰对克隆胚胎发育的影响，同时建立以锌指核酸酶技术为基础的动物转基因体细胞克隆技术平台。为锌指核酸酶技术结合体细胞核移植技术生产转基因克隆羊、转基因动物标记基因敲除提供理论和技术支持。

基因组靶向修饰是近年来生命科学研究的热点之一，特别是在基因功能分析、生产模式动物、治疗人类疾病和优良家畜育种等方面，基因组靶向修饰具有广阔的应用前景。本项目针对获得无标记基因转基因羊的目的和要求，在锌指核酸酶基因打靶载体构建、载体打靶功能检验、打靶效率和突变方式和山羊体细胞核移植等技术环节上开展了研究相关研究工作，建立山羊GFP基因组打靶相关技术体系，打靶效率达到5%；优化了山羊转基因克隆技术体系，获得了2只活的转基因克隆羊。为锌指核酸酶技术结合核移植技术生产转基因克隆羊、转基因动物标记基因敲除提供理论和技术支持。