多功能蛋白OsHAL3在水稻耐盐反应中的作用机理研究

植物HAL3蛋白家族是一类有较大应用潜力的新型抗盐蛋白，在不同生物中具有调节磷酸酶活性，参与辅酶A合成以及介导光调节植物生长等多种功能。HAL蛋白以何种功能在植物耐盐过程中起作用，以及作用的机理还不清楚。申请人克隆了水稻的OsHAL3基因并对其功能进行了鉴定，发现该基因编码的蛋白具有4′-磷酸泛酰半胱氨酸脱羧酶（PPCDC）活性。在日本晴野生型水稻中过表达OsHAL3或拟南芥AtHAL3a基因，均可以提高转基因植株叶片内的辅酶A含量,并提高转基因水稻对NaCl的耐性。本项目将在前期研究基础上，通过研究OsHAL3的PPCDC活性与该蛋白抗盐性能的关系，以及水稻体内辅酶A对其耐盐性的影响及作用机理，进一步揭示OsHAL3参与水稻耐盐反应的作用机制，寻找水稻中与OsHAL3和辅酶A相关的未知耐盐途径和抗盐基因，为了解植物耐盐机制提供新的线索和思路。

植物HAL3蛋白家族是一类有较大应用潜力的新型抗盐蛋白，在不同生物中具有多种功能。水稻中的OsHAL3蛋白是水稻中唯一的HAL3蛋白家族成员，与水稻的耐盐反应密切相关。OsHAL3具有CoA合成途径关键酶4′-磷酸泛酰半胱氨酸脱羧酶活性。OsHAL3在水稻耐盐反应中的作用机制还不清楚。 本课题通过在野生型水稻中过表达OsHAL3或AtHAL3a发现， OsHAL3在水稻中超表达后会提高辅酶A的合成水平，辅酶A升高后通过某些途径提高了植株内脯氨酸的含量，最终提高植株对盐胁迫的耐受性。在野生型水稻中超表达AtHAL3a基因也可以起到相似的作用。 利用拟南芥叶肉原生质体瞬时转化技术，对OsHAL3蛋白的亚细胞定位进行了研究，结果表明，OsHAL3蛋白定位于细胞质，这暗示着水稻中的4′-磷酸泛酰半胱氨酸脱羧酶催化4′-磷酸泛酰半胱氨酸脱羧生成4′-磷酸泛酰巯基乙胺的反应可能是在胞质中完成的。 通过分析OsHAL3基因在各种胁迫条件下的表达谱，明确了OsHAL3蛋白与离子胁迫和渗透胁迫的关系。实时定量PCR和RT-PCR结果表明，辅酶A合成的前体泛酸盐可以诱导OsHAL3转录水平的提高，而OsHAL3的转录丰度并没有受到NaCl、CaCl2、LiCl、MgCl2、ZnCl2和甘露醇等处理的影响。 通过构建一系列携带点突变OsHAL3蛋白的载体，利用互补实验发现，OsHAL3中保守的His91, Asn143, Met146, Asp178的突变对OsHAL3蛋白互补功能影响不大，表明这些氨基酸不是OsHAL3蛋白PPCDC活性的关键氨基酸位点。 此外,我们原核表达了OsHAL3-GST融合蛋白，并将诱导出的融合蛋白进行了纯化，浓缩。 以上结果对进一步揭示OsHAL3参与水稻耐盐反应的作用机制，寻找水稻中与OsHAL3和辅酶A相关的未知耐盐途径和抗盐基因提供了新的线索。