结核分枝杆菌sRNA功能及参与多药耐药和毒力调控研究

Small regulatory RNA (sRNA), also known as non-coding RNA, is regulators of bacteria and involves in multiple fundamental cellular events. Researching on the functions of sRNA and its target mRNA will contribute to clarifying the mechanism of post-transcriptional regulation in Mycobacterium tuberculosis. In this study, bioinformatics is used for predicting sRNA genes of Mycobacterium tuberculosis H37Rv, and high-throughput sequencing method for sRNA screening. Antisense sRNA amplification, isotope labelling probes, Northern Blot and Real-time quantitative PCR can be used to identify the expression of sRNA genes. At present, researches of target mRNA are mainly based on bioinformatic prediction and Gel Shift method, that can determine combination of sRNA and its mRNA target. The cloned sRNA sequences are conveyed into shuttle vectors, then transferred into Mycobacterium tuberculosis by the electrotransformation for making corresponding sRNA overexpression to observe the changes about growth status, virulence and drug resistance of the recombinant, to explore the functions of the target mRNA. Clinical multidrug resistant strains are isolated, and the expression differences of sRNA and its target are discovered between sensitive strains and multidrug resistant strains. Comprehensive data above, studying the functions of sRNA and its target will reveal the pathogenicity and multidrug resistance of Mycobacterium tuberculosis, and provide theoretical basis for the development of antituberculosis drugs.

sRNA（small regulatory RNA）是细菌中的调节因子，参与细菌的诸多重要生理过程，研究sRNA及其靶标mRNA的功能，将有助于阐明结核杆菌的转录后调控机制。本研究采用生物信息学预测结核分枝杆菌H37Rv的sRNA基因，高通量测序筛选sRNA；合成sRNA的反义链序列，以同位素标记作为探针，Northern Blot和实时定量PCR验证sRNA基因的表达；生物信息学预测sRNA的mRNA靶标，Gel Shift方法研究sRNA与mRNA靶标的结合；将合成的sRNA序列克隆到穿梭载体中，电转化的方式转入结核杆菌，使相应sRNA过表达，观察重组子生长状况及毒力、抗药性的变化，从而探究该靶标mRNA的功能；收集临床多药耐药菌株，研究其与敏感菌sRNA及其靶标的表达差异。综合以上数据，研究sRNA及其靶标功能，为揭示结核杆菌致病机理、多药耐药产生和抗结核药物的开发提供理论依据。

sRNA（small regulatory RNA），也称非编码RNA（non-coding RNA, ncRNA），是细菌中的新型调节因子。它们由基因组编码，但是绝大多数不编码蛋白产物，通过与mRNA分子互补配对作用或者影响蛋白分子的活性，参与细菌的重要生理过程。目前结核病的防控形势依然很严峻，基于分子水平研究结核分枝杆菌致病机理及多药耐药性的产生具有重要意义。结核杆菌可根据外界环境状态和免疫状态，促使sRNA调节自身基因表达，其在宿主体内的潜伏状态和耐药性的发生可能与sRNA的功能有关。结核分枝杆菌中仅有少量已经明确序列并被鉴定的sRNA，而对其功能和调控网络更是知之甚少。.本研究采用高通量测序与生物信息学结合预测结核分枝杆菌新的sRNA 1594条，并分析了它们在分枝杆菌中的保守性。建立结核分枝杆菌的铁剥夺模型后，提取总RNA建立了铁剥夺模型的转录组文库，分析得到缺铁环境下，结核分枝杆菌的转录组差异基因109个，差异sRNA 4个，并采用Northern blot 验证了sRNA-cs01，同时，启动子验证试验证实cs01和上游基因Rv3098A共转录。.用氨基糖苷类药物链霉素和卡那霉素分别作用于结核分枝杆菌，并建立转录组测序文库，发现差异sRNA共10条，其中位于基因组1512822-1513027的ms28是链霉素和卡那霉素刺激后共同下调的sRNA。通过软件和位置分析预测了每条候选sRNA的靶基因。采用Northern blot 和qRT-PCR检测链霉素和卡那霉素刺激后sRNA表达量变化，7条差异sRNA与分析结果一致。通过改造穿梭质粒PMV261，得到了ms28的过表达载体，电转入结核分枝杆菌从而构建了过表达株，经过表型分析和qRT-PCR检测，发现ms28高效表达后，前期预测的ms28靶基因中有6条上调，同时保守基因rrs、prpC、groES也上调，与电转入空载体的菌株相比，ms28过表达株与生长曲线左移，平台期提前3-4d。.本研究探索了结核分枝杆菌sRNA与物质代谢和耐药性产生的关系，并通过sRNA的靶标分析和功能试验揭示了初步的调控网络，为探索结核病耐药性产生和铁离子转运的sRNA调控机制提供了依据。