基于尿苷二磷酸葡萄糖原位再生全细胞催化甜菊糖改质的研究

甜菊糖是一种应用前景广阔的健康新糖源，但其总甙中含量最高的甜菊甙具有余苦味，影响甜菊糖味质。糖基转移酶UGT76G1能将甜菊甙催化为口感醇正、甜度高的莱鲍迪甙A，但必须以昂贵的尿苷二磷酸葡萄糖（UDPG）作为糖基供体。本项目在前期已高效表达UGT76G1的基础上，以建立高效经济的全细胞催化甜菊糖改质体系为研究目标，改造酿酒酵母代谢途径，采用代谢流和代谢控制分析方法，考察UDPG从头合成途径和再生途径上的关键酶对UDPG合成的影响，解析UDPG合成的代谢调控机理；合理调控UDPG代谢途径中多个关键酶基因的联合协同表达，最终获得理想的UDPG再生系统以匹配高效的糖基转移反应，提高甜菊甙的转化率，为建立适用于甜菊糖改质的全细胞催化工艺奠定基础，同时为解决糖苷合成过程中如何再生活化的糖基供体这一共性问题奠定理论基础和提供关键技术。

本项目针对糖苷合成过程中再生活化的糖基供体这一关键的共性问题，对催化甜菊甙(ST甙)生产莱鲍迪甙A(RA甙)的相关过程开展了较为全面的研究。利用酿酒酵母胞内尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)含量较高这一特点，通过对酿酒酵母宿主细胞的分子改造与调控，将外加相对廉价的碳源，如葡萄糖等在细胞内合成内源糖基供体，实现了全细胞催化莱鲍迪甙A合成过程中UDPG的原位再生，获得不依赖于外加昂贵糖基供体的改良型全细胞催化剂。采用组成型表达甜叶菊糖基转移酶UGT76G1的重组酿酒酵母，在25℃、pH8.0、柠檬酸钠15g/L，葡萄糖4%的条件下，转化2g/L ST甙，反应96h后RA甙产率为88.4%。此外，利用大肠杆菌能高效表达异源蛋白的特点，用其作为宿主，将蔗糖合酶与UDP-葡萄糖基转移酶共表达，对基于蔗糖合酶的UDPG再生体系进行了探索，并取得了较好结果。采用双酶催化体系，用UDP替代UDPG作为反应的起始材料，且UDP的加入量可极大降低。转化50g/L ST甙，仅添加1µM UDP，27h后RA甙产率为44.3%。本项目已发表论文4篇，获中国发明专利授权1项，培养研究生3名。