AmpR调控嗜麦芽窄食单胞菌产生诱导性β-内酰胺酶的分子机制

嗜麦芽窄食单胞菌产生诱导性L1、L2 β-内酰胺酶，使其对几乎所有β-内酰胺类抗生素耐药，已成为临床治疗难点。耐药基因诱导表达调控机制的研究，能为解决耐药性问题提供理论依据。本研究拟在前期研究的基础上，进一步探讨LysR类调控子AmpR对L1、L2酶的调控机制。通过PCR扩增和DNA测序分析ampR、L1和L2的基因分布、变异与耐药谱和耐药程度的关系；用荧光定量PCR分析抗生素诱导前后ampR、L1和L2的转录变化，明确基因变异和转录水平与耐药性的关系；利用穿梭载体构建ampR的突变株和互补株，比较分析野生株、突变株和互补株中L1、L2的转录水平及底物水解活性的变化，确定ampR对L1、L2调控作用；利用凝胶阻滞、引物延伸和DNase I足迹等方法，验证ampR对L1、L2的直接调控作用。综合以上数据，阐述AmpR对L1、L2调控的分子机制，为从分子水平阻断L1和L2酶的产生提供理论依据。

临床分离嗜麦芽窄食单胞菌99株， 以DNA为模板扩增L1和AmpR-L2基因， L1基因855bp，AmpR-L2 741bp，L1扩增阳性22株，ampR-L2阳性78株。99株临床菌株中对两种以上抗菌药物耐药93株，占93.9%。.分别用哌拉西林/他唑巴坦（PTC）和亚胺培南（IP）作为诱导剂，定量PCR方法检测AmpR表达量，发现在1倍MIC的PTC浓度时AmpR表达量较高。而检测诱导前后L1、L2酶活性均明显升高，显示ApmR可能调控两种酶的产生。设计引物扩增ampR编码区867bp，在大肠杆菌中表达AmpR蛋白，32KD，用western-blot验证。根据生物信息学预测结果，将启动子区500bp内的序列合成探针，在5’端加上生物素，进行靶基因的凝胶阻滞试验，证实L1不受AmpR蛋白的直接调控，而AmpR蛋白直接调控L2的表达。通过穿梭载体pEX18Tc进行AmpR蛋白的基因敲除，目前已进行蔗糖筛查。.利用多位点序列分析（MLST）对临床分离的18株嗜麦芽窄食单胞菌进行分子分型研究，结果显示ST 31型６株；ST4型4株；ST25、ST29型各３株；ST8、ST28型各2株。与其他分子分型方法比较，MLST能够揭示细菌长期进化和变异，便于不同地区之间的比较，提供了嗜麦芽窄食单胞菌分子流行病学研究的新方法。.利用DNA环介导恒温核酸扩增法（LAMP），建立快速检测临床分离嗜麦芽窄食单胞菌L2基因。该方法主要针对L2基因设计特异性引物，通过引物特异性识别特定BlaL2基因上的７个独立区域实现对耐碳青霉烯类嗜麦芽寡养单胞菌的检测。实时浊度仪监测反应结果表明，LAMP反应在65℃恒温条件下50min内完成；钙黄绿素可视化检测表明阳性结果呈绿色，与阴性结果差异显著。LAMP法最低检出基因的浓度为2.58pg/μl，其灵敏度为PCR法的100倍，且具有良好的特异性。因此，LAMP法具有过程简单、快速、结果肉眼可辨别、灵敏度高、特异性强等特点，适用于临床L2型基因的快速检测。.嗜麦芽窄食单胞菌临床株WJ66左氧氟沙星的MIC>32μg/mL（Etest法），表明对左氧氟沙星耐药。试验组用64μg/mL左氧氟沙星处理，对照组用等体积生理盐水培养WJ66菌株，30min后提取总RNA，然后测序并建库，试验组和对照组比较发现有256个上调基因，703个下调基因。聚类分析