糖基转移酶定向转化甜菊苷合成莱鲍迪苷M的底物识别和区域选择性机制研究

Diterpenoid glycosides rebaudioside M is a new generation of value-added products for natural sweetener Stevia glycoside series. Its content in Stevia rebaudiana is very low so that it is hard to be separated, and therefore difficult to scale production. In our previous study, a tomato-derived terpenoid glycosyltransferase SlUGT was found, which can catalyze glycosylation of the low price stevioside to produce rebaudioside M by a three-step glycosylation reaction, but its catalytic mechanism is not clear, limiting its engineering and application. In this project, the molecular modeling, site-directed mutagenesis, and X-ray crystal diffraction techniques will be used to establish a structural model of the enzyme and steviol glycosides. Using dynamic binding conformation analysis and the binding free energy calculation with QM/MM methods, the differences in binding modes of SlUGT and different aglycone substrates were compared, to elucidate the roles of key amino acid residues involved in the glycosylation of aglycone substrates, and to reveal the structural basis and catalytic mechanism of SlUGT on regioselective glycosylation of aglycone substrates. Through rational design, the novel glycosyltransferase will be obtained for directed conversion of stevioside to produce rebaudioside M, with remarkably improved efficiency. The research results will provide strategies and technical reference for artificially designing the terpenoid glycosyltransferases with high activity and high regioselectivity, and also provide a new way for the preparation of value-added Stevia glycoside products.

二萜类糖苷莱鲍迪苷M（RM苷）是天然甜味剂甜菊糖系列的新一代高值产品，其在甜菊中含量极低，分离难度极大，因而难以规模化生产。本课题组发现一种番茄来源的萜类糖基转移酶SlUGT可催化低值甜菊苷（St苷）经三步糖基化反应生成RM苷，但目前该酶的催化机制尚不明晰，限制了其改造和应用。本项目拟以SlUGT为研究对象，采用分子模拟、定点突变及X射线晶体衍射等技术，建立该酶与甜菊糖苷分子的结构模型，用动态结合构象分析和QM/MM结合自由能计算的方法，比较酶与不同苷元底物结合模式差异，阐明参与苷元底物糖基化的关键氨基酸残基的作用，揭示SlUGT对苷元底物实现区域选择性糖基化的结构基础和催化机制；通过理性设计，获得高效催化St苷定向合成RM苷的SlUGT突变体，显著提高RM苷合成效率。研究成果将为人工设计高活性高区域选择性的萜类糖基转移酶提供思路和技术借鉴，为高端甜菊糖苷产品的制备提供新途径。

本项目以催化甜菊糖苷类化合物糖基化的糖基转移酶（UGT）为研究对象，以实现新一代天然甜味剂莱鲍迪苷M的高效转化合成为目标，开展了UGT苷元底物区域选择性形成机制解析，新酶序列挖掘、酶分子设计与改造，以及甜菊糖苷生物转化过程研究。对UGTSL2（SlUGT）转化甜菊糖的主要产物进行分析和鉴定，解析UGTSL2的立体选择性和区域选择性：葡萄糖基添加至甜菊醇C19羧基部位连接的糖基上，优先顺序为：β1→2糖苷键＞β1→6糖苷键＞＞β1→3糖苷键，对其C13羟基上连接的糖基无催化活性或活性很低；首次报道UGTSL2催化甜菊苷合成莱鲍迪苷E；改造UGTSL2糖基化受体选择性，获得突变体N358F可特异性催化莱鲍迪苷A合成莱鲍迪苷D，以及催化甜菊苷合成莱鲍迪苷E。通过虚拟筛选和实验验证，获得UGT76G1的突变体S195Q，其通过改变活性口袋的形状，调整底物通道的方向和大小，更适合于与底物结合，对莱鲍迪苷E和莱鲍迪苷D的催化效率分别提高1.2倍和1.8倍；基于此，提出了从莱鲍迪苷E转化合成莱鲍迪苷M的工艺路线。依据UGT结构特征基序进行序列挖掘，筛选并鉴定得到5条可催化多种甜菊糖苷的UGT（序列间相似性28–57%）；对其中LbUGT和NtUGT进行了性质表征和新产物鉴定，解析了LbUGT催化甜茶苷进行两步连续糖基化的区域选择性，采用共识序列策略有效提高了NtUGT的稳定性，获得了颇具开发潜力的新型甜菊糖苷衍生物。利用糖基转移酶与蔗糖合酶的偶联反应，建立起经济高效的糖基供体UDP-葡萄糖的原位再生系统，实现了莱鲍迪苷E、D、M、M2等的高效生物转化合成。此外，还通过序列挖掘和分子改造得到低等真核生物微芒藻属来源蔗糖合酶McSuSy的突变体，该酶最适pH为7.0，最适温度为60°C，偏好UDP为核苷酸底物，为酶促糖基化过程开发与放大提供了有力的工具酶。