Ago2磷酸化在DNA损伤修复中的功能分析

Our lab previously found a novel type of small RNAs produced from the sequences in the vicinity of DNA double-strand break (DSB) sites in human cells. They are referred to as diRNAs for DSB-induced small RNAs. Ago2 binds to diRNAs and recruit diRNAs to DSB sites. The recruitment of Rad51, a protein assisting in DSB repair by homologous recombination (HR), requires the formation of Ago2/diRNA complex. Phosphorylation is an important way to regulate the activities of proteins involved in DNA damage response. We identified five sites that can be specifically phosphorylated in response to DSB in human Ago2. The mutations of these sites lead to reduced HR efficiency, suggesting that these phosphorylation events play key roles in DNA damage repair. Our study aims at: 1) determine whether the mutations of these phosphorylation sites affect the binding between Ago2 and diRNAs, the binding between Ago2 and Rad51, the recruitment of Rad51 to DSB sites; 2) explore the cell cyle regulation of Ago2 phosphorylation; 3) identify kinases responsible for Ago2 phosphorylation. Our study will provide significant new insights into the regulatory mechanisms for Ago2 and diRNA functions in DSB repair.

申请人所在实验室发现一类产生于DNA双链断裂（double strand break, DSB）位点附近序列并在DSB修复中起重要作用的新的小RNA，diRNA。diRNA和Ago2组成的复合体促进DSB修复蛋白Rad51被招募到DSB位点，从而促进DSB修复以同源重组的方式完成。磷酸化是调节众多已知参与DNA损伤应答的蛋白活性的重要方式。我们前期研究发现，DNA损伤可特异性地在Ago2上的5个位点诱导产生磷酸化修饰，并且这些磷酸化位点的突变严重影响DSB修复效率。本项目将在此发现的基础上，进一步探索Ago2磷酸化在DSB修复中的作用机理。我们将研究：1）磷酸化在Ago2结合diRNA 和Rad51以及DSB位点招募Rad51的作用；2）Ago2磷酸化是否受细胞周期调控；3）鉴定参与Ago2磷酸化的激酶。本项目研究结果对于阐明Ago2和diRNA在DSB修复中的功能及其作用机理有重要意义。

修复DNA双链断裂损伤对于维持基因组稳定性至关重要，因此，研究DNA双链断裂修复机制有助于我们了解维持基因组稳定性的关键点。之前本研究组发现一类新的受DNA双链断裂诱导产生的小RNA，这类小RNA被称为diRNA并被证明在DNA双链断裂修复中起重要作用。在人的细胞中，diRNA与Ago2相结合。diRNA/Ago2复合体指导DNA损伤修复关键因子Rad51被招募到DNA双链断裂位点，从而促进DNA损伤修复通过同源重组的方式发生。Ago2在正常和缺氧条件下的活性通常通过磷酸化修饰来调节，但是Ago2在DNA损伤条件下是否被磷酸化以及这些磷酸化事件所起的作用都是未知的。通过这项研究，我们证实Ago2的四个位点（S798, S752, T759, S760）在伽玛射线造成DNA双链断裂后被磷酸化。这些磷酸化位点的突变导致不同程度损伤修复效率的下降及Rad51点状结构形成缺陷，其中S798的突变对修复事件的影响最为严重。S798的突变不影响Ago2和diRNA以及Rad51的结合。通过ChIP实验，我们进一步阐明了Ago2的S798A变异体不能结合到DNA损伤修复位点，从而导致Rad51点状结构形成缺陷及同源重组修复效率下降。我们的研究揭示了Ago2的DNA损伤修复功能的一种新的调控机制。