sRNA-051调控高毒力肺炎克雷伯菌耐药及毒力变化的机制研究

Carbapenem-resistant hypervirulent Klebsiella pneumoniae (CR-hvKP) isolates have emerged and are being reported worldwide, which often display multi-drug resistance,relatively high level of virulence and big trend to develop severe sepsis and posed a serious health threat to human beings. Bacterial sRNAs (small regulatory RNAs) can act as regulators to participate in various physiological activities and environmental perception. However, there is no report on the roles of sRNA in the resistance and virulence of CR-hvKP. Our previous study showed that the sRNA-051 expression in the CR-hvKP induced by imipenem was increased, and it’s absence could reduce the resistance and virulence of CR-hvKP. Thus we hypothesize that the sRNA-051 may regulate the resistance and virulence of CR-hvKP through the interaction with special mRNA. This study will explore the regulation effect on the resistance and virulence of CR-hvKP by using the sRNA-051 gene-deletion and over-expression mutants of CR-hvKP and a mouse model of sepsis, and identify the special mRNA interacting with sRNA-051 by bioinformatics prediction and comparative proteomics analysis. This study will provide a new way to control the resistance and virulence of CR-hvKP through clarifying the mechanism of regulations of sRNA-051.

碳青霉烯类耐药高毒力肺炎克雷伯菌（CR-hvKP）在全球范围内产生和流行，具有强毒力、多重耐药、易感染成重症等特点，严重危害人类健康。sRNA（small regulatory RNA）是细菌的调节因子，参与感应环境和生理调节等重要过程。但sRNA在CR-hvKP菌株耐药及毒力中的作用尚未见报道。前期采用高通量测序及qRT-PCR验证发现sRNA-051在亚胺培南诱导产生CR-hvKP中表达上调，缺失sRNA-051可降低其抗药性及毒力。因此，我们假设sRNA-051通过影响CR-hvKP菌特定靶标mRNA表达及功能，进而调控其抗药性和毒力。本项目拟构建sRNA-051缺陷及过表达菌，结合小鼠脓毒症模型，探讨其对CR-hvKP耐药及毒力的调控作用，并通过生物信息学预测联合比较蛋白组学，鉴定与sRNA-051相互作用的靶标mRNA，探讨其调控分子机制，为控制CR-hvKP播散提供新途径。

近年高毒力肺炎克雷伯菌毒力及耐药率不断提升，明确其耐药和毒力的形成机制是控制高毒力高耐药肺炎克雷伯菌流行的关键。sRNA是近年来在细菌中发现的一类RNA调控因子，在耐药、致病等方面起着重要作用。本项目围绕高毒力肺炎克雷伯菌sRNA-051来开展研究，项目的主要研究内容包括sRNA-051敲除后毒力及耐药性改变机制、sRNA-051的表达分析及Hfq依赖性鉴定，预测sRNA-051靶基因及sRNA-051-hfq可能的调控轴及机制研究等。本项目在流行病学及体外实验上证实了毒力及耐药质粒的接合转移及重组是导致江西CR-hvKP菌流行的重要原因，率先发现sRNA-051可直接调控CR-hvKP菌的毒力及耐药性，并证实了其具备伴侣蛋白hfq依赖性。在sRNA-051调控基础上，敲除hfq基因证实了其对高毒力肺炎克雷伯菌生理、环境适应性及毒力致病性具有重要的调控作用，尤其在pH9、pH5.5、0.7 mmol/L SDS、5% NaCl、1%H2O2环境和50℃高温等环境胁迫条件下，△hfq缺失株生长受到显著抑制，生物膜形成能力也显著降低，荚膜形成能力下降显著，线虫实验及中性粒细胞杀菌实验证实其毒力下降明显。转录组学数据证实其对铁离子摄入系统、生物膜调控系统、荚膜多糖合成系统等相关基因表达均显著影响，尤其magA、rmpA、peg334等毒力基因。此外在sRNA-051-Hfq研究的基础上，根据其调控的特异性靶基因PEG334设计引物，建立LAMP快速检测高毒力肺炎克雷伯菌的方法。研究成果已发表标注本项目资助论文15篇，其中SCI论文13篇；培养博士生3名，硕士生6名，项目主持人荣获江西省金牌研究生导师称号。直接申请肺炎克雷伯菌检测相关国家发明专利3项和实用新型专利1项。综上所述，我们全面完成了本项目研究任务。