传染性造血器官坏死病毒感染性克隆嵌合病毒的构建及其免疫原性研究

Infectious hematopoietic necrosis virus (IHNV) is the causative agent of infectious hematopoietic necrosis (IHN),which causes fish infectious diseases with hematopoietic organ necrosis as the main pathological characteristics.IHN is one of the most important fish diseases in the world,which brings significant economic loss in the aquaculture farming.To effectively control IHN,using reverse genetics, molecular biology,molecular virology and infection experiments in this study,an attenuated IHNV strains generated,further study on immunogenicity of its chimeric virus,analysis its role in the delivery of molecular antigens.This project intends to use IHNV reverse genetics system operating platform,IHNV G protein virulence genes with different mutations will be generated using reverse genetics,obtain attenuated infectious clone of IHNV strain;Further NV gene will be replaced with model molecular EGFP,protective antigens molecular of IPNV,the chimeric virus will be generated;The juvenile rainbow trout were inoculated by intraperitoneal injection with chimeric virus,to evaluate the effectiveness of the chimeric virus by detecting antibody,cytokine levels of juvenile rainbow trout, in vitro lymphocyte and immune neutralization assay.For provide the technical platform to research the new type of attenuated IHNV vaccine and polyvalent vaccine,and the powerful immune prevention methods to control of fish viral disease outbreaks.

传染性造血器官坏死（IHN）是由传染性造血器官坏死病毒（IHNV）感染鱼类以造血器官坏死为主要病理特征的传染性疾病，是世界各国鱼类重要疫病之一，其潜在危害十分巨大。为有效控制IHN，本研究集成反向遗传学技术、分子生物学、分子病毒学技术及感染实验获得IHNV弱毒株，进一步研究其嵌合病毒的免疫原性，阐明IHNV感染性克隆传递分子抗原的作用。本项目拟利用IHNV反向遗传系统操作平台，以rIHNV HLJ-09为主体骨架，对G蛋白毒力基因位点进行突变，获得IHNV感染性克隆弱毒株；进一步用EGFP、IPNV保护性抗原替代NV基因，获得表达外源分子抗原的IHNV嵌合病毒；将嵌合病毒腹腔注射接种虹鳟幼鱼，检测虹鳟幼鱼抗体产生及细胞因子水平，结合体外中和试验和淋巴细胞增殖实验评价嵌合病毒的免疫效力。为IHN新型减毒活疫苗和多价疫苗的研究提供技术平台和理论依据，为控制鱼类病毒病的爆发提供强有力的预防手段。

传染性造血器官坏死病毒（Infectious haematopoietic necrosis virus，IHNV）感染鱼类以造血器官出血、坏死为主要病理特征的一种高度传染性和急性病毒性疾病是我国及世界各国家鲑鳟幼鱼死亡的重要疫病之一。免疫接种是预防病毒疾病的有效方法，减毒活疫苗具有接种量小、免疫原性强和免疫效果好而持久的优点。本研究利用反向遗传学技术，构建了具有SnaB I和Spe I分子标识的IHNV HLJ-09株的反向遗传系统，获得了突变体IHNV感染性克隆弱毒株rIHNV-N438A，进一步用EGFP、IPNV VP2基因替换NV基因，获得含有报告基因增强型绿色荧光蛋白（rIHNV-N438A-ΔNV-EGFP）和IPNV外衣壳蛋白VP2（rIHNV-N438A-ΔNV-VP2）的两株重组毒，重组病毒可以稳定传代并能够表达外源蛋白。虹鳟稚鱼接种rIHNV HLJ-09或亲本毒wtIHNV HLJ-09后存活率仅为10%，rIHNV-N438A组存活率达到45%，而拯救的重组毒rIHNV-N438A-ΔNV-EGFP、rIHNV-N438A-ΔNV-VP2组，存活率高达97%。两株重组病毒能够促进鱼体IFN1、IL-8、IL-1β的表达，与亲本毒wtIHNV HLJ-09以及rIHNV-N438A相比差异显著（P<0.05），能够刺激机体产生抗IHNV的IgM，而免疫rIHNV-N438A-ΔNV-VP2后能够产生抗IPNV的IgM，且保持较高的抗体水平；对免疫后的虹鳟分别用亲本毒wtIHNV HLJ-09和IPNV Sp强毒株进行攻毒，免疫rIHNV-N438A-ΔNV-EGFP、rIHNV-N438A-ΔNV-VP2后对虹鳟抗wtIHNV HLJ-09的相对免疫保护率达到81.5 %~84.6%，免疫rIHNV-N438A-ΔNV-VP2组的抗IPNV Sp攻击的相对免疫保护率高达88.9 %。综合以上试验结果表明，拯救的rIHNV-N438A-ΔNV-VP2感染性弱毒株可诱导机体产生免疫应答，对抗IHNV和IPNV的感染均具有保护作用，可作为IHNV和IPNV二联弱毒疫苗的候选毒株，为IHN减毒多价活疫苗和分子标记疫苗等新型疫苗的研究提供技术平台及理论依据。