Dock3/Paks对癫痫突触可塑性的调控及异常神经网络形成机制研究

The mechanisms of epilepsy still remain incompletely understood. Abnormal synaptic connection between neurons, pathological reconstruction of neurocircuitry and the reconstruction of the synaptic plasticity provide anatomic basis of epileptogenesis. In our previous study, we found that the expression of Dock3 were significant increased in temporal lobe epilepsy patients and animal epilepsy models compared with normal controls. Electrophysiological studies also showed that Dock3 shRNA treatment resulted in significantly decreased the frequency of action potential and mEPSC in the hippocampal slices. And Dock3 shRNA significantly decreased the average amplitude of NMDA-EPSC without affecting the AMPA current. Dock3 shRNA also impaired the severity of status epilepticus during the acute stage in animal models. But the specific molecular mechanism is unclear. In this study, we use electrophysiological, cell culture, molecular neurobiological and animal behavior observation to explore the mechanisms of Dock3 on the structure and function of hippocampus neuron dendritic spines and abnormal neural network. We hypothesized that Dock3 involved in epileptogenesis process associated with abnormal reconstruction of neurocircuitry through its downstream protein Paks/limk1,2 by affecting the depolymerization balance of actin and microtubule. In this study, we try to prove Dock3 is involved in synaptic plasticity and the formation of abnormal neural network. And to further explore its mechanism by electroneurophysiology and molecular biotechnology in epileptogenesis. This experiment will provide new therapeutic targets for the treatment of epilepsy.

癫痫的发病机制尚不完全清楚，神经元之间异常突触联系和病理性神经环路的形成为癫痫的发生提供了解剖学基础。我们最近发现癫痫患者及动物模型脑组织中异常表达Dock3，电生理研究提示Dock3对海马锥体神经元兴奋性有显著影响，且Dock3 shRNA干预影响了海马锥体细胞NMDA受体依赖的突触后电流。为进一步探讨Dock3在癫痫发生中的作用及其机制，本研究拟通过体外细胞培养、离体脑片与动物实验相结合的方法，运用神经电生理、神经行为学及分子生物学等技术研究Dock3对癫痫形成影响，从而在多个层面论证我们的设想。我们提出假说：Dock3通过激活相关下游信号分子Paks/limk1,2影响了肌动蛋白的解聚平衡，与异常神经网络形成有关，且影响突触可塑性改变，参与了癫痫的发生。上述问题为进一步阐明Dock3信号通路在癫痫发生中的分子机制，寻找新的药物治疗靶点和药物提供理论依据。

癫痫是最常见而严重的神经疾病之一，致病因素作用于脑部后会引起分子、细胞及神经网络水平的改变，难治性癫痫形成是神经元重组导致异常神经网络形成的结果。与癫痫相关的突触可塑性改变包括海马苔藓纤维出芽、新突触形成与突触突触重建等是癫痫频繁发作和难治的重要原因。对致痫性脑损伤后癫痫形成的相关分子通路的干预，可能是阻止癫痫形成的重要环节。我们研究了癫痫患者及点燃动物模型脑组织中 Dock3 的表达，发现其表达明显降低，用匹罗卡品和戊四氮两种动物模型，通过海马注射慢病毒转染沉默 Dock3 基因表达后，提示阻断 Dock3 后癫痫发作的易感性降低，在点燃动物前沉默 Dock3 基因表达，发现随后进行的点燃动物中慢性期自发性癫痫鼠的发作率明显减少，表明 Dock3 参与了癫痫的发生发展，慢病毒干预鼠的苔藓纤维芽生明显减少，提示其可能通过调节细胞骨架蛋白的平衡发挥了抗癫痫作用。那么其机制是否与其下游通路 Rac1/PAK1/2 或与 Rac1/ERKs通路有关是本研究需要解决的问题。我们完成了该项实验，得到了如下结果：1.采用人颞叶癫痫患者标本、氯化锂-匹罗卡品和戊四氮癫痫动物模型，Dock3在癫痫脑组织中表达增加，主要在脑组织中皮层神经元及海马锥体细胞，在癫痫发作慢性期表达仍高。2. 通过氯化锂-匹罗卡品癫痫动物应用 Dock3 基因沉默技术，观察在Dock3 基因沉默前后癫痫发作级别减低、癫痫发作潜伏期延长；Timm指数降低，脑电图有相同的改变， Dock3 腺病毒干预后神经元 mEPSC 频率明显降低。认知功能在癫痫发作慢性期下降；3. 探讨 Dock3激活Rac1，并且激活了Pak1、ERK1/2 通路，提示Dock3参与癫痫发生于 Pak1/Limk1， ERKs 通路的变化相关。进一步明确 Dock3 参与了癫痫的发生的具体作用机制，为今后颞叶癫痫药物的开发提供理论依据。