扶正解毒法对HIF-1α介导的肿瘤相关巨噬细胞促微淋巴管生成的调控研究

近期研究表明肿瘤间质中的巨噬细胞即肿瘤相关巨噬细胞(TAM)并非发挥抗肿瘤作用，而是参与肿瘤的侵袭和转移，其中促进肿瘤微淋巴管生成是TAM影响肿瘤术后转移和复发的关键机制，HIF-1α介导的PTEN/PI3K/Akt/mTOR信号传导通路是TAM促进肿瘤微淋巴管形成的重要途径。前期自然基金课题显示：扶正中药通过保护肿瘤失巢凋亡发挥防治肿瘤转移的作用，但防治疗效有待进一步提高，结合我科长期防治肿瘤转移的临床研究提出扶正解毒法是防治胃癌术后转移的基本法则，干预巨噬细胞功能是其重要机制之一。本课题拟通过FCM、IHC和Luminex xMAP等技术及低氧工作站等手段，从体内和体外、带瘤和术后双方面观察扶正解毒法对不同亚型巨噬细胞分化的诱导及HIF-1α介导的TAM促微淋巴管生成的PTEN/PI3K/Akt/mTOR途径的影响，进一步揭示扶正解毒法防治肿瘤复发和转移的相关机制。

多年的临床经验和实验研究显示扶正解毒法是防治肿瘤术后复发转移的重要治疗法则，其机制与提高机体免疫监视功能、降低肿瘤细胞的免疫逃逸有关。在前期研究的基础上，我们提出中医药对 TAM 的免疫重塑是中医药肿瘤治疗的新靶点，扶正解毒方对 TAM 的调节是中医药防治肿瘤转移的可能机制。.　　　本课题从体内、体外两个方面展开研究。动物实验，造模：建立荷前胃癌（FC）的615小鼠模型和术后复发转移模型，同时设立空白对照组、模型对照组、中药组、化疗组、中西医结合组。检测：获取各组小鼠脾脏和肿瘤组织中巨噬细胞，RT-PCR方法检测巨噬细胞相关分子CCL3、CCL22、iNOS和Arg I的表达水平；用FACS检测巨噬细胞中CD16/32+和CD206+细胞所占比例，通过酵母菌吞噬试验评估其功能。观察扶正解毒中药对小鼠巨噬细胞分化、TAM所占比例及相关的细胞因子IL-4、IL-10、IL-13、TGF-β分泌水平的影响。同时检测肿瘤组织及转移淋巴结中PTEN、PI3K、Akt、mTOR、HIF-1α、TGF-β的表达情况。细胞实验：制备扶正解毒中药含药血清；采用流式细胞术检测不同干预下肿瘤相关巨噬细胞（TAM）表型和功能的变化；使用PCR技术检测TAM中HIF-1α的表达情况；通过低氧工作站，模拟肿瘤组织中低氧环境，用FACS检测巨噬细胞中M1及M2型比例，观察扶正解毒中药对巨噬细胞的作用；使用PCR技术检测HIF-1α的表达情况，使用ELISA法检测TGF-β的表达情况；通过以EBM-2为培养基，基质胶作为支持物的aaMphi转分化系统，观察扶正解毒中药对巨噬细胞转分化为淋巴管内皮细胞中的作用，其中VEGF-C作为阳性诱导剂。.　　　结果论：扶正解毒方联合化疗能有效抑制小鼠前胃癌生长，减轻荷瘤小鼠肺转移程度，延长生存期，改善荷瘤小鼠预后，其作用机制在于抑制HIF-1α介导的PTEN /PI3K/Akt /mTOR信号传导通路，减轻肿瘤组织中M2巨噬细胞浸润程度，减少 M2 型巨噬细胞的含量从而抑制肿瘤微淋巴管的生成；降低血清中 M2 型巨噬细胞诱导因子及所分泌的免疫抑制因子 IL-4，IL-10，IL-13，TGF-β的含量；降低免疫抑制细胞（CD206+F4/80+巨噬细胞）在脾脏中的中的含量，重塑机体免疫功能。