l-CaD在牙周膜细胞成牙本质分化过程中的功能和机制研究

The interaction between stem cells and materials on cell differentiation and tissue regeneration is one of the hot topic in regenerative medicine. The cytoskeleton is the major factor in cell-material interaction. However, the mechanism of the biomaterials based bio-root regeneration is still unclear. Our previous study (Exp Cell Res. 2016) found that the cytoskeleton binding proteins such as low molecular weight caldesmon (l-CaD) may be the key regulator in dental derived stem cell differentiation and tooth root regeneration. Treated dentin matrix (TDM) is a natural extracellular matrix (ECM) material with odontogenic differentiation ability. However, the function and molecular mechanism of l-CaD in the interaction between TDM and dental derived stem cells are still unclear. In this study, the role of l-CaD in TDM-induced periodontal ligament cells differentiation will be investigated through TDM and periodontal ligament cell co-culture system. The dynamic changes of actin cytoskeleton will be used as the starting point to elucidate the mechanism of l-CaD in the process of odontogenic differentiation of periodontal ligament cells. In addition, the role of l-CaD in tooth development will be discussed. This study will provide new molecular mechanism for the differentiation of dental derived stem cells and further provide theoretical basis for TDM-induced odontogenic differentiation and tissue regeneration.

干细胞与材料之间的相互作用对细胞分化和组织再生的影响是当前再生医学研究中的热点，细胞骨架是细胞与材料之间相互作用的主要因素，然而基于生物材料的生物牙根再生分子机制尚不清楚。申请人前期研究发现（Exp Cell Res. 2016），细胞骨架结合蛋白l-CaD等可能是牙源性干细胞分化及牙根再生的重要调控分子。处理牙本质基质（TDM）是一种具有成牙本质诱导功能的天然细胞外基质（ECM）类材料，然而l-CaD在TDM与牙源性干细胞之间的相互作用中的功能和调控机制尚不清楚。本研究拟通过TDM与牙周膜细胞共培养体系，研究l-CaD在TDM诱导牙周膜细胞成牙本质分化中的作用，以肌动蛋白细胞骨架的动态变化为切入点，阐明l-CaD在牙周膜细胞成牙本质分化过程中的机制，并分析l-CaD在牙胚发育中的作用。本研究将为牙源性干细胞分化提供新的分子机制，并为TDM诱导细胞成牙本质分化和组织再生提供理论依据。

项目组前期研究发现细胞骨架结合蛋白l-CAD可能是牙源性干细胞分化及牙根再生的重要调控分子，处理牙本质基质（TDM）是一种具有成牙本质诱导功能的天然细胞外基质（ECM）类材料。为研究l-CAD在牙周膜干细胞成牙本质/成骨分化中的作用以及阐明TDM的微环境构成，本项目分离鉴定了人牙周膜干细胞，采用western blot技术检测成牙本质/成骨分化过程中l-CAD的表达变化情况，结果发现l-CAD的表达随时间出现降低。采用细胞划痕、transwell、茜素红染色、CCK-8实验检测干扰和过表达CALD1对牙周膜干细胞生物学特性的影响。结果发现干扰CALD1表达后人牙周膜干细胞迁移能力增强，成牙本质/成骨分化增强，过表达CALD1表达后人牙周膜干细胞迁移能力减弱，成牙本质/成骨分化减弱。而细胞增殖能力不受干扰或者过表达影响。采用GR及p53信号通路抑制剂处理细胞，发现l-CAD的表达无显著变化。将干扰CALD1表达的牙周膜干细胞进行RNA-seq，结果发现差异基因与肌动蛋白丝结合等有关。采用肌动蛋白聚合抑制剂和促进剂处理牙周膜干细胞，结果发现肌动蛋白的聚合与成牙本质/成骨分化正相关。通过免疫荧光染色发现，干扰和过表达CALD1对牙周膜干细胞的F-actin细胞骨架无显著影响。将干扰和过表达CALD1的牙周膜干细胞植入裸鼠皮下，对照组和过表达CALD1的牙周膜干细胞组中无明显的矿化组织形成，而沉默CALD1的牙周膜干细胞与羟基磷灰石复合后形成了明显的矿化组织。采用原有方法制备TDM，提取总蛋白，进行FASP酶解，再进行LC-MS质谱分析。结果发现TDM所构成的成牙微环境中含有708种蛋白质，数量超过了前期所有已发表的数据。进一步从总共318个糖基化位点中鉴定出208种糖蛋白，包括DSP、EMILIN-1等。对出生后大鼠进行连续取材和切片，进行H&E及IHC染色，结果发现EMILIN-1表达于大鼠牙根发育的整个过程，在牙根发育的过程中主要参与硬组织（包括牙本质、牙骨质、牙槽骨）的形成。本研究初步阐明了CALD1在牙周膜干细胞成牙本质/成骨分化过程中的作用和机制，并首次阐明了TDM的总蛋白和N-糖蛋白构成，为成牙诱导微环境的重建提供了新的理论依据。