Clusterin通过线粒体凋亡通路调节肝细胞肝癌化疗耐受机理的研究

肝细胞肝癌的多药耐药抵抗是导致肝癌化疗效果差的最重要原因之一。最新研究表明：Clusterin(sCLU)可通过调节肿瘤细胞线粒体凋亡通路中的相关蛋白，提高肿瘤化疗敏感性，但其作用机制尚不清楚。我们前期实验研究发现，对sCLU高表达的人肝癌细胞系应用shRNA载体封闭后，可显著提高肝癌对奥沙利铂的敏感性。在此基础上，我们拟应用sCLU过表达载体转染sCLU低表达的人肝癌细胞系的研究模型，通过体内、体外实验对照观察奥沙利铂、吉西他滨对肿瘤生长的影响，应用蛋白芯片、免疫共沉淀、共聚焦显微镜、透射电镜等技术探索sCLU对凋亡信号通路中上、下游靶向蛋白的相互调控机制、定位和功能的改变；探讨调控线粒体通路中靶向蛋白后化疗疗效的变化，为更深入的进行肝癌化疗耐药机理的研究提供理论和实验依据。

目的：原发性肝癌是严重威胁人类健康的恶性肿瘤，寻找到细胞毒性较小的化疗药物并探索出肝癌对化疗药物的耐药机制从而提高肝癌的化疗敏感性在临床工作中具有较为重要的意义。方法：选择肝癌细胞系，检测细胞中sCLU蛋白的表达情况。针对clusterin设计干扰载体并构建过表达载体。干扰载体和过表达载体转染筛选出的sCLU蛋白不同表达的肝癌细胞，检测表达水平，筛选封闭效率最强的干扰靶点。对细胞系应用不同剂量的奥沙利铂处理后用CCK-8法检测细胞的存活率，分析sCLU不同表达对于奥沙利铂的药物敏感性的变化，分析其对药物的IC50。调节sCLU蛋白表达，用流式细胞仪Annexin V+PI双染法检测蛋白调节前后细胞的凋亡情况。转染Bel7402、SMMC7721后，应用SABiosciences RT2Profiler PCR方法检测sCLU蛋白封闭后其下游的凋亡信号通路中相应靶基因的表达。体内实验验证sCLU蛋白的作用。结果：筛选的五种肝癌细胞系中，Bel7402、SMMC7721、HepG2三株细胞系存在sCLU蛋白高表达，而Bel7404和SNU739呈低表达。流式细胞仪检测细胞凋亡实验表明，封闭sCLU蛋白的表达后再联合应用奥沙利铂能够明显地增加肿瘤细胞的凋亡率，而过表达后再联合应用奥沙利铂其凋亡率降低。检测下游靶点的基因表达变化，筛选出4个上调基因，其中以AKT1的变化最为明显。分别检测Bel7402sCLUlow，SMMC7721sCLUlow，Bel7404-sCLUhigh及其亲本细胞单独或联合应用奥沙利铂处理后对下游Bcl-2家族蛋白的表达影响， OXA处理和sCLU封闭表达都能够上调Bax表达及下调Bcl-2表达，而封闭sCLU表达后再联合应用OXA处理能够更明显地降低Bcl-2/Bax的比率。在Bel7404细胞中，通过流式细胞仪检测细胞凋亡发现，单纯应用TCN能够明显增加细胞凋亡率，应用TCN处理后再过表达sCLU，则能够逆转这种现象。在体内实验中， OXA处理能够减少肿瘤的体积约为45.1%，但是在对照组和sCLU干扰组之间，肿瘤的体积并没有明显变化，在封闭sCLU蛋白表达后联合应用OXA能够进一步减小肿瘤的体积。结论：本研究进一步验证了sCLU蛋白在肝癌中存在高表达，同时也支持了sCLU蛋白在原发性肝癌中是一个具有细胞保护功能的调节靶点.