细菌角蛋白酶KerF降解角蛋白过程与分子机制

Keratins are insoluble fibrous proteins and are difficult to be degraded. Recent studies revealed many microorganisms and keratinases that can degrade keratins, but the degradation process and mechanism are still elusive. This project is to elucidate the degradation process and mechanism of natural keratin substrates by a keratinase KerF, which is secreted by a bacterium Stenotrophomonas maltophilia YHYJ-1. Firstly, we will monitor the degradation process of natural keratin substrates (wool and chicken feather) by KerF using light microscopy, scanning electron microscopy (SEM) and Atomic force microscopy (AFM) and determine the cleavage sites on the substrates with HPLC and LC-MS. Secondly, we will determine the potential function of C-terminal PPC domain in the keratin degradation and the key residues of KerF in the keratin degradation by using bioinformatics and site-directed mutational analyses. Lastly, the degradation process of natural keratin substrates by another typical kertinase KerA and the cleavage sites on these substrates will be studied and compared with that of KerF. The implementation of project will gain insights into the degradation process and mechanism of the natural keratins by a microbial keratinase KerF.

角蛋白是一大类结构复杂的难降解纤维状蛋白质，目前已发现多种能降解角蛋白的微生物和角蛋白酶，但对于角蛋白酶降解角蛋白的过程和机制还很不清楚。本项目以细菌嗜麦芽窄食单胞菌YHYJ-1分泌的角蛋白酶KerF为研究对象，利用光镜、SEM、AFM和生化手段，研究角蛋白酶KerF降解天然角蛋白底物的过程中底物微观结构的变化和酶切位点，阐明角蛋白酶KerF对角蛋白的降解过程；利用生物信息学分析、定点突变和生化手段研究角蛋白酶KerF催化结构域中结合和催化角蛋白底物的关键区域和关键氨基酸残基，以及其C-端PPC结构域在角蛋白高效降解中的潜在作用，阐明角蛋白酶KerF高效降解角蛋白的分子机制；研究典型角蛋白酶KerA对天然角蛋白底物的降解过程和酶切位点，并与KerF比较来揭示不同角蛋白酶降解天然角蛋白的过程的异同。本项目将首次系统揭示细菌角蛋白酶降解不溶的天然角蛋白底物的过程和机制。

本项目以一种来自嗜麦芽窄食单胞菌Stenotrophomonas maltophilia YHYJ-1的新型角蛋白酶KerF、以及一种来自枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis FJ-3-16的典型角蛋白酶Ker FJ为研究对象，纯化了两种角蛋白酶，系统研究了两种酶的酶学性质、并利用目视观察和扫描电镜观察了两种酶对天然角蛋白底物羽毛和羊毛的降解过程，以及在该降解过程中底物结构的变化。B. subtilis FJ-3-16是一株角蛋白酶高产菌株，能高效降解畜禽角蛋白废弃物，角蛋白酶Ker FJ 作为该菌分泌到胞外的主要蛋白酶，能够高效作用于驴皮、羊皮的酶法脱毛，且该酶稳定性、抗逆性良好，具备开发成工业脱毛用角蛋白酶制剂的潜力。为提高其产酶量，本项目综合利用单因子实验、Plackett-Burman（PB）设计和中心组合设计（Central composite design, CCD）优化了B. subtilis FJ-3-16的摇瓶产酶发酵条件，使胞外酶活提高了2.5倍，并建立了利用50 L发酵罐生产角蛋白酶的发酵工艺。本项目进一步利用菌株发酵液对巴马香猪的猪蹄、猪头皮张及猪蹄整蹄进行脱毛，效果显著，表明B. subtilis FJ-3-16在巴马香猪为代表的难脱毛生猪的脱毛应用中具有极好的应用前景。角蛋白酶在角蛋白废弃物的降解和循环利用中发挥着重要作用，但目前关于其降解角蛋白的过程和机制还很不清楚。为满足羽毛、皮毛、蹄角等角蛋白废弃物高效转化的需要，急需筛选和鉴定新型的、具有更高活力的角蛋白酶资源，并开发新型角蛋白酶制剂。本研究为实现角蛋白酶的工业化应用奠定了基础。