基因定点插入技术体系在小麦中的建立及应用

Wheat is a major crop cultivated all over the world, and its production is of great importance for food security. With the gradual completion of wheat genome sequencing，a key factor for wheat breeding is whether researchers can efficiently modify wheat genes. At present, using genome editing tools (such as CRISPR/Cas9), targeted gene knock-out and base substitution have been successfully applied in wheat, however, targeted insertion wheat mutants have never been achieved. The applicant is engaged in plant genome editing since the period of graduate students, and can expertly modify genes of different plants. Homologous recombination (HR), homology-mediated end joining (HMEJ), micro-homology-mediated end joining (MMEJ) and homology-independent targeted integration (HITI) are the main methods for targeted insertion. In this project, we will compare and optimize the efficiency of these methods in wheat, and develop an efficient targeted gene insertion technology. In the meanwhile, a CRISPR/Cas9 DNA-free insertion technology will also be established combining the transient expression of CRISPR/Cas9 system. The application of these technologies will promote the study of gene function and crop improvement in wheat.

小麦是一种在世界各地广泛种植的主要粮食作物，其生产关系到世界和我国的粮食安全。随着小麦基因组测序的逐步完善，能否高效地对小麦基因组进行改造，是未来小麦新品种选育的关键。当前，利用基因组编辑技术（CRISPR/Cas9等）已经成功地在小麦中实现了基因的定点敲除及高效的单碱基替换，但是尚未真正地在小麦中实现基因的定点插入。申请人在研究生期间，一直从事植物基因组编辑相关的工作，能够熟练地对不同植物的基因进行编辑。同源重组(HR)、同源序列介导的末端连接(HMEJ)、微同源序列介导的末端连接(MMEJ)、以及不依赖同源序列的定点插入(HITI)是现阶段实现基因定点插入的主要方法，本项目在小麦中比较并优化这四种方法的工作效率，建立高效的基因定点插入技术体系；同时结合瞬时表达CRISPR/Cas9的方法，拟在小麦中建立较高生物安全性的定点插入技术体系，推动小麦的基因功能及品种改良研究。

小麦是一种在世界各地广泛种植的主要粮食作物，在小麦中实现基因的定点插入具有非常重要的意义。现阶段在生物中实现基因定点插入的方法主要有4种：同源重组、同源序列介导的末端连接、微同源序列介导的末端连接以及不依赖同源序列的定点插入。本项目分别以小麦TaGASR7和TaGW2基因为靶基因，以报告基因GFP或小分子His蛋白标签作为外源待插入基因，构建这4种定点插入方法所需的16个载体，随后利用小麦原生质体瞬时转化体系比较这4种定点插入方法的工作效率。实验结果表明在小麦中这4种定点插入方法均不能准确的实现大片段的定点插入，但是可以实现分子标签的准确插入。最后利用农杆菌侵染小麦幼胚的遗传转化方法，获得了His DNA定点插入的小麦突变体，这对后续小麦基因功能研究及小麦中目的产物的提取和纯化具有重要意义。