多位点遗传操作技术体系的建立及在作物育种中的应用

CRISRP/Cas9-mediated gene editing is one of the essential breakthrough technologies in life science and is facilitating both basic researches and therapeutic practices. Our previous work developed a polycistronic tRNA-gRNA (PTG)/Cas9 methodology which provides a general and highly-efficient platform for simultaneous editing multiple targets for genetic analysis. In this proposal, we will further optimize the PTG/Cas9 methodology and establish more genetic manipulation methods and applications to facilitate basic research and crop breeding. We propose using PTG/Cas9 to: (1) functional knock-out a microRNA in rice; (2) establish methodology for polyploidy crop genome editing and use it to improve nutrition quality of rapeseed; (3) establish methodology for simultaneously transcriptional activation of multiple genes and use it to improve rice drought tolerance. This study will provide novel methods for multiplexed genetic manipulation to promote basic research and also provide new strategies for crop genetic improvement of complicate traits. Moreover, this work will also provide a framework of PTG/Cas9 technologies and applications for other organisms.

基于CRISPR/Cas9的靶向基因编辑技术是最近两年生命科学领域最关键的技术突破之一，极大的推动了医学和生命科学研究的发展。我们的前期工作开发了适用于不同生物的polycistronic tRNA-gRNA(PTG)/Cas9技术，为生物学研究提供一个新型的、高效率的多位点基因组编辑平台。在此基础上，本申请将建立和完善的基于PTG/Cas9的多位点遗传操作技术体系，并将之应用于：(1)敲除水稻microRNA功能；(2)建立适用于多倍体作物的靶向基因编辑工具，并用来改良油菜的营养品质；(3)建立多基因同时转录激活技术，并用来改良水稻抗旱性。通过本研究，我们将建立一套以PTG/Cas9为基础的遗传学研究的新工具，不仅能推动植物学基础研究的发展，还将为作物复杂性状的改良提供新的思路和技术，同时也为PTG/Cas9技术在其他物种中的应用提供借鉴。

CRISPR/Cas9基因编辑技术的迅速发展为生物的遗传改良提供了前所未有的便利。在前期研究中，我们利用了生物体内保守的tRNA加工系统，创建了将tRNA与gRNA串联（polycistronic tRNA-gRNA）的方法用于CRISPR/Cas9基因编辑。为了进一步提升基因编辑的效率，开发多样化的遗传操作工具，从而满足植物遗传改造的不同需求，本项目在前期工作的基础上开展了以下研究。（1）基于真核生物内含子剪接的原理，我们建立了一个新的方法同步表达Cas9和gRNA。该方法将串联的tRNA-gRNA元件置于Cas9基因的内含子中，这样用一个Pol II启动子驱动一个融合基因就可以高效率、同步地表达Cas9和gRNA。除了Cas9外，改造后的内含子也可以与其他基因（如筛选标记、报告基因等）融合，也可以整合到基因的不同位置。我们的研究结果表明这一策略可高效率的编辑水稻基因，而且也适用于不同的CRISPR系统。由于内含子剪接在真核生物中高度保守，该方法可以广泛地用于植物、动物和真菌的基因编辑技术中。（2）建立CRISPR-P 2.0 生物信息学平台。该平台为50个以上的植物基因组提供基因编辑靶位点设计服务，同时支持多个不同的CRISPR系统的引导RNA设计，为国内外的植物科研人员进行基因编辑的工作提供了有用的工具。（3）对水稻microRNA基因miR164的基因进行了靶向突变，获得了相关材料，为深入研究miR164的功能提供了基础。综上所述，本项目的研究结果为CRISPR/Cas基因编辑工具的开发提供了新的策略，为植物基因编辑技术提供了支持。