长余辉纳米探针在淋巴瘤相关microRNAs的检测及荧光示踪的应用研究

MicroRNAs comprise an abundant class of small noncoding RNAs which are related with many cancers, thus the quantification of the microRNAs and the research on the cellular location and the motion of microRNAs are important for both the early diagnosis of malignant tumor and the clarification of effect taken by microRNAs on the pathogenesis and the development. However, the development of the optical detection and the fluorescen imaging of microRNAs are still limited by the high background fluorescence from samples and the poor photo-stability of probe which is unconformable for optical tracking. Aiming to explore the detecting and the tracking of microRNAs specially related with lymphoma, a serial long afterglow nanomaterials with different elements, different fluorecence wavelength and novel fluorescence lifetime as long as several hours will be developed. Combining the merits from the long afterglow materials including the low background fluorescence, the simplicity of synthesis and the low toxicity, and those from molecular beacon including the high selectivity and sensitivity, the in vitro detection of microRNAs will be accomplished; with the improvement of the spacial and temporal resolution and the elongation of tracking peroid, the cellular location and the dynamic motion of the microRNAs within lymphoma cells will be studied. The results will promote the progress of bio-nanotechnology on the earlier detection of cancers.

微RNA(microRNAs)是一类短小的非编码RNA，研究表明它与多种癌症相关，因此，分析microRNAs的浓度、分布和运动对于肿瘤的早期诊断以及阐明microRNAs在肿瘤发生、发展中的作用具有重要的意义。然而，现有microRNAs的光学检测和成像技术仍存在以下局限：背景荧光干扰、探针易被光漂白而不适于跟踪观测。针对淋巴瘤特异性microRNAs的体外检测及活细胞内示踪成像，本课题设计构建一系列元素组成不同、荧光波长各异、余辉长达数小时的发光纳米材料，利用该材料的余辉时间长、背景干扰低、制备简单、纳米尺寸和组成元素低毒甚至无毒等优点以及分子信标技术的高选择性和高灵敏度的特点，实现淋巴瘤相关的典型microRNA的体外检测，并在进一步提高空间、时间分辨率和延长观测时间的基础上，考察microRNAs在淋巴瘤细胞内的分布与运动，所取得的研究结构将推动生物纳米技术癌症早期检测方面的发展。

微RNA(microRNAs)是一类短小的非编码RNA，研究表明它与多种生理、病理现象相关，因此，分析microRNAs的浓度、分布和运动对于肿瘤的早期诊断以及阐明microRNAs在肿瘤发生、发展中的作用具有重要的意义。然而，现有microRNAs的光学检测和成像技术仍存在以下局限：背景荧光干扰、探针易被光漂白而不适于跟踪观测。本项目在以下方面进行了研究并取得了进展：a. 利用共沉淀法制备了Tb3+掺杂GdF3纳米粒子，研究了TAT肽的存在对于提高材料入胞效率的作用，并优化了单个长余辉纳米材料上修饰TAT的数目。以寡核苷酸单链probe I 偶联GdF3:Tb3+纳米粒子作为供体，以寡核苷酸单链probe II 偶联金（Au）纳米粒子作为受体，利用供体与受体之间的FRET检测目标miRNA hsa-miR-122-5p浓度，并通过设置多功能酶标仪的检测延迟去除自发荧光背景以提高灵敏度。该传感器能够高灵敏度、高特异性的检测目标分子，能够避免自发荧光干扰。对hsa-miR-122-5p的检测线性范围为0.1 fmol/L～100 pmol/L，与同类型的RNA荧光传感器的最佳检测限具有可比性。基于纳米粒子的时间分辨FRET生物传感器用于血清和组织切片中microRNAs的无扩增检测具有良好的灵敏度和特异性； b. 利用表面活性剂辅助、水热合成法制备了Cr3+单掺杂、Cr3+&Eu3+共掺杂、Cr3+&Pr3+共掺杂和Cr3+、Yb3+和Er3+共掺杂ZnxGayGe(4-x-y)O4纳米粒子，所制备纳米粒子均具有良好的水相单分散性，可以254nm紫外灯激发、持续发射6小时以上、以808nm激光重新活化后仍可发光数小时。对该纳米粒子表面先后以氨基硅氧烷、寡核苷酸单链probe功能化，进而构建了长余辉纳米粒子与金纳米粒子之间的FRET体系。将此系列TR-FRET型探针应用于肿瘤细胞系中特定microRNAs的半定量检测及PLIM成像：分别以培养细胞和细胞培养液为检测对象，研究了不同探针对细胞培养液内目标microRNAs的灵敏度和选择性，建立针对高表达、高分泌microRNAs的体外定量检测方法；考察了该探针对几种肿瘤细胞的穿透能力、细胞毒性以及胞内稳定性，实现了细胞内特定microRNAs的PLIM成像。所取得的研究结果将推动生物纳米技术癌症早期检测方面的发展。