一个水稻花粉萌发孔发育相关的GDSL脂肪酶基因的功能分析

Rice pollen aperture is a specialized structure in exine and is very important for exine keeping integrity, pollen maturing completely and pollen tube germinating. However, the little is known about the molecular mechanism underlying the aperture development in rice. In addition, the role of GDSL-lipase gene in pollen development is extremely unclear. We found a novel rice male sterility mutant displaying an unique phenotype: pollen aperture operculum missing (AOM), also presenting some familiar sterile character such as: white anther,small and abnormal pollen, and no starch accumulation. By mapbased cloning, we have isolated a GDSL-lipase gene as the candidate gene of OsAOM(aperture operculum missing),and found a T→C mutation resulting a amino acid substitution of Cys→Arg in the mutant of osaom. We plan to characterize the mutant detail phenotype by using light and electron microscope; validate the function of OsAOM gene by genetic complement experiment; investigate the expression pattern of OsAOM gene by RNA in situ hybridization, Q-PCR and subcellular localization;analyze the protein structure of this GDSL-lipase and perform the phylogenetic analysis; and testify the lipase activity of OsAOM and osaom protein. At last, we expect to clarify the function of OsAOM gene in rice aperture development. After this research, we may get the proof of OsAOM gene controlling the aperture development, approach to the molecular mechanism of aperture development and learn more about the GDSL-lipase role in pollen maturation.

水稻花粉萌发孔是花粉外壁中的一种特化结构，其正常发育对维持外壁完整性、花粉完全成熟和花粉萌发来说非常重要，然而水稻萌发孔发育的分子机制尚不清楚。此外，GDSL脂肪酶基因在水稻花粉发育中的作用很不清楚。我们发现一个新颖的水稻雄性不育突变体，除带有一些常见的不育特征外，其特别之处在于：花粉萌发孔孔盖丢失。图位克隆表明这个萌发孔孔盖丢失基因OsAOM为一个GDSL脂肪酶基因，基因突变（T→C）使得相应氨基酸由Cys变为Arg。本项目打算用光镜、电镜等对突变体的表型进行详细观察；用遗传互补验证该基因的功能；用原位杂交、Q-PCR、亚细胞定位等手段，研究该基因的表达模式；分析OsAOM蛋白结构和进化；检测该基因野生型蛋白产物和突变蛋白的脂肪酶活性。最终阐明OsAOM基因在花粉萌发孔发育中的作用机制。本研究将有利于认识水稻花粉萌发孔发育的分子机制，有利于认识GDSL脂肪酶基因在花粉发育中的作用。

萌发孔是花粉外壁中的一种特化结构，是花粉管伸出的通道，而花粉外壁是花粉抵御外界逆境的重要屏障。因此，萌发孔的正常发育对花粉充分成熟并完成授精具有重要作用。目前有关萌发孔的研究主要集中在其发生过程的观察，以及不同植物萌发孔形式的比较上，而对萌发孔发生发育的分子机制研究较少。GDSL脂肪酶基因是发现较晚的脂肪酶基因亚家族。目前有关该类基因的研究在细菌中较多，而在植物中的研究非常有限。水稻基因组中共有114个GDSL脂肪酶基因，仅极少数得到详细研究。我们通过图位克隆分离到一个GDSL脂肪酶基因OsAOM基因，利用突变体及野生型开展了以下研究：突变体表型的详细分析；功能互补的遗传分析；OsAOM基因表达的组织特异性；OsAOM蛋白亚细胞定位；OsAOM蛋白的生化功能分析；基因及蛋白的信息学分析等。主要结果如下：OsAOM基因位于第二染色体左臂，编码一个GDSL脂肪酶，该基因的野生型转入突变体后能恢复其育性；该基因在四分体及单核小孢子期的花药绒毡层中高表达，其蛋白产物在花药第9期早期聚结在花粉外壁，原核表达具有明显的脂肪酶活性；该基因突变后从花药发育第10期开始出现明显异常，花粉细胞膜降解，细胞内壁不能起始发育，萌发孔盖丢失，细胞质降解流失，最后形成的花粉小而畸形，萌发孔通透，花药颜色偏白，体积偏小，导致花粉彻底不育，自交不能结实。上述的研究意义在于：发现并验证了一个新的雄性不育基因；明确了一个GDSL脂肪酶基因调控花粉发育的分子机理，增加了GDSL脂肪酶的生物学功能的认识；增加了萌发孔发育的分子机理的认识。