小麦基因定点突变技术体系建立及在春化作用机理研究上的应用

Wheat is one of the world's most important food crops. However, the complexity of its genome and genetic background led to the difficulty of genetic analysis and low efficiency of genetic transformation. The functional genomics research in wheat was therefore greatly restricted. Artificially engineered nucleases, including zinc finger nucleases (ZFNs) and TALE nucleases (TALENs), are the recently developed site-directed mutagenesis technologies. The great potentials of ZFNs and TALENs have been successfully exploited in a variety of plants and animals. Based on our efficient and stable wheat transformation platform, in this study, we attempts to develop efficient site-directed mutagenesis in wheat using custom-designed zinc finger nucleases and TALENs. Furthermore, ZFNs and TALENs recognizing the wheat flowering genes VRN1, VRN2, VRN3 will be made and introduced into wheat genome. By phenotypic and genetic analysis for the mutants, we will describe the functions and interactions of these three genes in mechanism of vernalization in wheat. The efficient site-directed mutagenesis in wheat will provide an effective technology for wheat functional genomics research and targeted improvements of wheat variety.

小麦是世界上最重要的粮食作物之一，但小麦复杂的基因组和遗传背景导致了其遗传分析困难，遗传转化效率低下，大大限制了小麦功能基因的研究。因此，在小麦中建立高效的功能基因组学研究方法极为重要。人工核酸酶，包括锌指核酸酶（ZFNs）和TALE核酸酶（TALENs）是近几年发展起来的高效的基因定点改造技术，目前在多种动植物中的成功利用，显示了其巨大的潜力。在我们已经建立的小麦规模化遗传转化平台的基础上，本研究试图在小麦中建立锌指核酸酶（ZFNs）和TALE核酸酶（TALENs）定点突变技术体系，再选用小麦开花基因VRN1、VRN2和VRN3作为内源基因突变的对象，通过ZFNs和TALENs对它们进行定点改造，结合表型分析和遗传学分析，进一步阐述这三个基因在小麦春化调控途径中的功能和相互作用。高效的小麦基因定点突变技术体系的建立将为小麦功能基因组学的研究和小麦品种的定向改良提供一个有效的手段。

小麦是异源六倍体植物，其基因组庞大（约17.1Gb）、遗传背景复杂、且80–90%的序列为重复序列，这些都成为限制小麦基础研究和应用研究发展的主要因素。人工核酸酶是最近几年发展出来的基因定点突变技术，主要包括ZFNs、TALENs及CRISPR/Cas9三类，此技术在小麦中的建立，会为小麦的基因组学研究和品种定向改良带来巨大的推动作用。小麦春化作用的研究对提高小麦的区域适应能力及产量具有重要的意义，我们利用人工核酸酶基因定点突变技术对小麦春化作用的重要基因TaVRN1，TaVRN2，TaVRN3（FT）进行定点编辑，首次完成：.1）构建了报告基因GFP和GUS的农杆菌表达载体，获得了过表达GFP和GUS基因的小麦株系；.2）高效的小麦、二穗短柄草原生质体分离转化体系的建立；.3）TALENs介导的二穗短柄草基因组编辑技术体系的建立；.4）TALENs介导的小麦基因组编辑技术体系的建立；.5）CRISPR/Cas9介导的小麦基因组编辑技术体系的建立；.6）在小麦原生质体中获得了小麦春化基因TaVRN3有活性的TALENs；.7）在小麦原生质体中获得了小麦春化基因TaVRN1和TaVRN3有活性的CRISPR/Cas9位点； .8）通过未经春化处理和经过不同程度春化处理的小麦为材料，比较春化基因CRISPR/Cas9位点的活性，探讨春化作用与TaVRN基因的表达量及CRISPR/Cas9位点活性的关系。.本研究探讨了不同的基因组编辑技术在小麦中实施的可行性，为小麦重要基因功能的研究和遗传改良提供了依据；同时对春化相关的基因进行定点编辑，对研究小麦的春化作用机制具有重要意义。