β1-肾上腺素受体自身抗体干扰心肌细胞自噬节律参与心功能不全的机制研究

The circadian oscillations of autophagy is more significant than autophagy function in the maintenance of cardiac function, however, the factors and mechanisms that affect circadian autophagy rhythm remain unclear. We originally found β1-adrenergic receptor autoantibodies (β1-AA) could cause cardiac dysfunction that was accompanied by autophagy rhythm disturbance. In the present study, β1-AA immunization mouse model will be established to observe the time course of autophagy rhythm and the role of autophagy rhythm disturbance in heart dysfunction induced by β1-AA using transmission electron microscopy, virus infection and so on；The Per2::Luc mice and Per2 knockout or overexpression mice will be used to observe the role of abnormal Per2 transcription in autophagy rhythm disturbance induced by β1-AA using Lumicycle and lentivirus infection；Separation of cell components, immunofluorescence, living cell workstation, immunoprecipitation and phosphorylation site mutation will be used to prove that β1-AA could increase the phosphorylation of Bmal1 by activing PKA so that Bmal1 protein will accumulate in the cytoplasm and could not enter the nucleus, which inhibit Per2 transcription and disturb autophagy rhythm. The purpose of this study is to provide therapeutic targets for the prevention and treatment of autophagy related cardiovascular diseases from perspective of circadian rhythm.

细胞自噬的昼夜节律性震荡，比自噬功能本身对于心脏功能维持的意义更大，但影响自噬节律的因素和机制并不清楚。本课题组原创性发现，β1-肾上腺素受体自身抗体（β1-AA）在引起心功能不全的同时，伴有自噬节律紊乱。本研究拟在此基础上建立β1-AA免疫小鼠模型，采用透射电镜、病毒感染等技术观察β1-AA导致心肌细胞自噬节律变化的时间规律及其与心功能不全的关系；选用Per2::luc小鼠及Per2敲除或过表达小鼠建立β1-AA免疫模型，采用Lumicycle及慢病毒感染等技术观察Per2转录异常在β1-AA诱导的自噬节律紊乱中的作用；利用细胞组分分离、免疫荧光、活细胞工作站、免疫共沉淀、磷酸化位点突变等技术证明β1-AA通过增加PKA对Bmal1蛋白的磷酸化作用，使其累积在细胞浆不能入核从而抑制Per2转录引起自噬节律紊乱。本研究拟从生物节律的角度为防治自噬紊乱相关心血管疾病提供依据及治疗靶点。

心力衰竭是各种心血管疾病的终末阶段。随着社会老龄化的日益加剧，全球心衰患病率及死亡率均处于持续上升阶段，其中我国占1/3。研究表明，维持细胞正常运转的多种生物学活动具有昼夜节律变化，包括自噬。众所周知，人类心血管不良事件在清晨频发，此时自噬活动正处于较低水平，提示心衰的发生可能与一天中的自噬昼夜节律波动有关，因此，寻找心衰进程中引起自噬昼夜节律紊乱的因素及相关机制尤为重要。.β1-肾上腺素受体自身抗体（β1-adrenergic receptor autoantibodies，β1-AA）是在40%-60%的心力衰竭患者血清中存在的可持续激活β1-肾上腺素受体（β1-adrenergic receptor，β1-AR）的自身抗体。本研究发现，β1-AA是心衰进程中引起心肌细胞自噬节律紊乱的重要因素，主要表现为主动免疫小鼠在L/D和D/D环境下心肌组织LC3及P62蛋白的节律表达出现破坏。β1-AA直接作用于心肌细胞也可引起自噬节律紊乱，改善自噬节律紊乱可逆转β1-AA诱导的心肌细胞死亡和心功能不全。通过慢病毒敲低及过表达心肌细胞Per2发现Per2转录抑制是β1-AA诱导自噬节律紊乱的重要机制，进一步通过质核分离，免疫荧光染色及活细胞工作站等实验研究发现β1-AA诱导的Bmal1蛋白磷酸化增加使Bmal1稳定在细胞浆不能入核，进而导致Per2转录抑制。生信预测及Co-IP实验证实PKA是磷酸化Bmal1蛋白的重要激酶。由此得出结论，β1-AA通过激活PKA，磷酸化Bmal1蛋白使Bmal1稳定在细胞浆不能入核，导致Per2转录抑制，是引起自噬节律紊乱参与心功能不全的重要机制。进一步基于质谱及Co-IP实验研究发现Per2转录抑制引起的PER2蛋白表达下调可导致PER2蛋白与G3BP1蛋白相互作用减弱，使G3BP1不能发挥抑制mTORC1的作用，导致mTORC1活化诱导心肌自噬节律紊乱，引起心肌细胞死亡，从PER2蛋白下调的角度探究心肌细胞自噬节律紊乱的全新机制。本研究从调整生物节律的角度为β1-AA阳性心力衰竭患者的精准治疗提供潜在靶点。