BRCA1基因甲基化对乳腺癌放射敏感性的影响研究

It is important to investigate the strategies for sensitizing breast cancer to irradiation while decreasing adverse effect and toxic effect of adjacent normal tissues. BRCA1 gene plays a key role in radiation-induced DNA repair processes and the inhibition of it can enhance the radiosensitivity of tumor cells. Because of the important biological role in the carcinogenesis of sporadic breast cancers for BRCA1 gene promoter methylation, it is meaningful to study the relationship between BRCA1 gene promoter methylation and radiosensitivity of breast cancer. In this study by RNA-directed DNA methylation (RdDM) we will construct lentivirus vectors for short hairpin RNAs (shRNA) targeted to BRCA1 promoter and evaluate their effect on the radiosensitivity of different breast cancer cells, normal breast cells and nude mice model. Also, we will detect the regulation effects of induction of BRCA1 gene promoter methylation and expression silencing targeted by short interfering RNAs. In addition, the study of DNA methyltransferases on RdDM will be carried out to further explore the mechanism of foundation and maintenance for epigenetics. This research will provide the experimental data and theoretical support for the new therapy method in breast cancer.

探寻影响乳腺癌辐射敏感性机制并加以调节，对提高其放疗效果、降低放疗副反应具有重要意义。BRCA1是辐射诱导DNA损伤修复中重要的分子，抑制其表达可提高辐射敏感性。在散发性乳腺癌中由于BRCA1基因甲基化较突变起更重要的作用，探讨该基因甲基化与肿瘤辐射敏感性关系更具有实际意义。本研究采用RNA指导的DNA甲基化（RdDM）技术构建出可高效靶向BRCA1基因甲基化的shRNA慢病毒载体，选择不同侵袭能力的乳腺癌细胞系及正常乳腺细胞系和荷瘤小鼠为研究对象，通过体内外实验探讨靶向BRCA1基因甲基化对乳腺癌细胞的放射敏感性影响，同时评估RdDM对目的基因启动子甲基化及转录沉默的调控效能，并通过对靶向基因甲基化过程中DNA甲基转移酶的作用机制探索，研究表观遗传的建立维持机制，为肿瘤新治疗提供实验数据和理论依据。

非编码RNA能够在转录水平、转录后水平以及翻译水平对基因表达进行调控,产生抑制或激活效应，此过程涉及DNA甲基化、组蛋白修饰及染色质重塑。RNA介导DNA甲基化（RdDM）是转录水平基因表达调控的重要形式之一，能够在转录水平实现基因表达沉默。人乳腺癌易感基因1（BRCA1）是参与辐射诱导 DNA 损伤修复过程的重要分子，抑制其表达可提高肿瘤细胞的辐射敏感性。在散发性乳腺癌中，BRCA1 基因甲基化较突变起着更为重要的作用，探讨该基因甲基化与肿瘤辐射敏感性之间的关系更具实际意义。本研究采用RNA介导DNA甲基化（RdDM）技术，构建可高效靶向 BRCA1 基因甲基化的干扰载体，选取侵袭力不同的乳腺癌细胞系，探讨靶向 BRCA1 基因甲基化对乳腺癌细胞放射敏感性的影响，评估RdDM对目的基因启动子甲基化及转录沉默的调控效能。以BRCA1启动子区4个不同的CpG岛为靶序列，设计了17个靶向不同的干扰靶点，构建5个shRNA慢病毒及12个siRNA质粒，用于在三株人乳腺癌细胞中靶向诱导DNA甲基化。发现干扰片段导入后在MDA-MB-435、MDA-MB-231、MCF-7细胞中分别有8/17、14/17、8/17个靶点的调控效应表现为抑制。焦磷酸测序分析有8个位点的甲基化水平发生变化，但与阴性对照组比较，甲基化水平无统计学差异。QPCR检测RdDM过程相关基因表达情况。在靶向Site 1的慢病毒感染MDA-MB-435细胞后，RdDM过程相关基因DNMT1表达下降、而DNMT3A、DNMT3B、HDAC1及AGO1表达上升，靶向Site 1和Site 3慢病毒感染MDA-MB-231细胞后也出现了相似现象，但与对照组相比基因表达均无统计学差异。采用克隆形成实验和MTT法，检测细胞的放射敏感性，细胞存活率降低，克隆形成数降低，细胞增殖减慢，表明细胞辐射敏感性提高。本研究为RdDM技术的研究及应用提供了实践及理论基础，为乳腺癌治疗新方法提供了实验及理论依据。