蓝舌病病毒样颗粒展示外源表位的研究

Our objective is to identify some specific regions of bluetongue virus (BTV) virus-like particles (VLP) that can display heterologous epitope and demonstrate its potential as immunogenic vehicle. So we predict and select appropriate loop regions in VP2 protein to insert foreign epitope. A series of chimeric VLPs are constructed through the insertion of a neutralizing epitope (8E8) derived from type O FMDV into different loops of VP2 protein using adenovirus expression system. Then the expression of VP2 protein and the inserted epitope and VLP assembly are detected in the chimeric VLP. The appropriate inserted sites of VP2, which could not only display foreigen epitope but also not affect VLP assembly, are determined by comparing the flexibility and tolerance of the sites inserted by epitope.To assess immunogenicity of the chimeric VLP, sera from mice and sheep immunized with the chimeric VLP, VP2 protein and epitope 8E8 are evaluated. The VLP immunogenicity proper displaying heterologous epitope, in combinantion the advantages of adenovirus vector, will facilitate the development of chimeric VLP immunogen. These results will lay the foundation for the BTV multi-serotype of chimeric VLP vaccine, provide new ideas for the prevention and control of bluetongue disease.

采用缺损型腺病毒（Ad5）为载体、以蓝舌病病毒（Bluetongue virus，BTV）8型病毒样颗粒（Virus-like particles，VLP）为骨架，将O型FMDV的保守中和表位插入BTV-VLP表面VP2蛋白的不同loop区，检测表位的插入对VP2蛋白单体功能、三聚体形成以及VLP组装的影响，筛选出可容纳外源表位并且展示在VLP表面的VP2插入位点，从而将外源表位嵌合在BTV-8 VLP的主要免疫优势区。之后将腺病毒载体化的嵌合VLP免疫小鼠和绵羊，检测VLP及其展示表位诱导的免疫应答。本研究将缺损腺病毒载体优势与BTV-VLP的免疫原性优势相结合，期待在BTV-VLP的侧翼序列支持下正确展示外源表位的免疫原性，获得该嵌合抗原表位的优势结构特征。这些研究结果，为深入探讨BTV-VLP对于外源表位插入的耐受性和稳定性具有指导意义，也为BTV嵌合VLP多价疫苗的研究提供理论依。

蓝舌病是由蓝舌病病毒（Bluetongue virus，BTV）引起的反刍动物的一种严重的烈性传染病，为OIE规定的必须通报的疾病，我国将其列为一类动物传染病。该病的死亡率平均为30%，其中绵羊的死亡率50-70%。目前已发现BTV有26个血清型，且各血清型之间不能交叉保护。病毒样颗粒（Virus-like particles, VLP）不含核酸，最大程度地模拟了天然病毒粒子的强免疫原性，可诱导机体产生特异性体液免疫和细胞介导免疫，能区分自然感染和疫苗免疫动物，而且稳定性好不易失活，成为BTV新型疫苗研究的热点，目前报道的BTV VLP均是针对单一血清型，需要联合使用，生产工艺复杂、成本高。本研究组的最终目标是，用BTV-8 VLP作为骨架展示其他血清型BTV的中和表位，构建嵌合型VLP用作BTV多价疫苗。而本立项的研究目标是，在BTV-8 VLP骨架上筛选合适的插入位点，既能够正确展示表位，又不影响VLP组装。.采用人缺损型腺病毒（Ad5）为载体、以BTV-8 VLP为骨架，将O型FMDV的保守中和表位8E8插入BTV-VLP表面VP2蛋白的不同loop区，检测表位插入对VP2蛋白单体功能、三聚体形成以及VLP组装的影响，筛选出可容纳外源表位并且展示在VLP表面的VP2插入位点，从而将外源表位嵌合在BTV-8 VLP的主要免疫优势区。首先对VP2蛋白结构进行同源建模，选择28个插入位点，经过瞬时表达初筛，重组腺病毒稳定表达，最终筛选获得了11个可展示外源表位的位点。对展示的8E8表位进行Western blot、IFA鉴定，结果表明8E8表位能够正确展示，具有反应原性，插入8E8表位不影响VP2蛋白三聚体的形成。但由于不同表位抗原性不同，诱导抗体水平存在差异。本项目中表达嵌合8E8表位VP2蛋白的重组腺病毒免疫小鼠诱导抗体水平较低。此结果仍需其他方法进一步验证。下一步计划对展示表位系统进行优化。本研究为深入探讨BTV-VLP对于外源表位插入的耐受性和稳定性具有指导意义，也为BTV嵌合VLP多价疫苗的研究建立理论和实验基础。