猪脾树突状细胞对携带外源抗原表位的猪细小病毒样颗粒提呈机制研究

携带外源抗原表位的嵌合型猪细小病毒样颗粒（PPV-VLPs）可以被提呈进入MHC I类分子途径并活化外源抗原表位特异的杀伤性T细胞（CTL），其机制目前并不明确。本研究依据树突状细胞（DCs）是目前已知功能最强的抗原提呈细胞（APC），也是唯一可以提呈PPV-VLPs到CD8+T细胞的APC，在已经成功构建了携带猪瘟病毒CD8+T细胞表位的猪细小病毒样颗粒（PPV-VLPs-E290）基础上，选用猪脾DCs作为APC，通过PPV-VLPs-E290在脾DCs内的定位检测、DCs对PPV-VLPs-E290的体内外提呈检测、以及不同药物和配体对DCs提呈PPV-VLPs-E290可选择途径的抑制实验，阐明DCs提呈嵌合型PPV-VLPs进入MHCI类分子途径并激发所携带抗原表位特异性CTL反应的机制，为开发防治猪瘟和猪细小病毒病的颗粒化疫苗及插入多个抗原表位的嵌合型VLPs疫苗奠定理论基础。

携带外源抗原表位的猪细小病毒样颗粒，接种动物后，可激发抗原表位特异的CTL反应，其机制目前并不明确。为了探明该机制，首先将病毒样颗粒（PPV-VLPs-E290）用荧光素FITC标记后，免疫仔猪，通过磁性筛选的方法从免疫猪脾脏分离树突状细胞（DC）；或体外与非免疫猪DC在37℃下作用，应用流式细胞仪检测体内、外DC对PPV-VLPs的捕获情况。捕获PPV-VLPs的DC用皂苷透化后，分别与内吞体的表面标志分子Rab5、Rab7、Rab11、Lamp2单克隆抗体及PE标记的PPV-VP2抗体反应，通过共聚焦显微镜检测PPV-VLPs在DC中的定位情况；经氯丙嗪，、二甲基氨基吡咪、松胞素D、菲律平等药物及肌动蛋白、小窝蛋白（caveolin-1）、DEC-205抗体等DC细胞表面受体的配体处理后的DC，再PPV-VLPs-E290作用，共聚焦显微镜及流式细胞仪检测DC对PPV-VLPs-E290内吞的方式；分别用伯氨喹、放线菌酮、氯喹、乳胞素、布雷菲德菌素A及亮抑肽酶、胃酶抑素与DC作用，通过乳酸脱氢酶释放试验检测细胞的杀伤效率，检测DC内吞PPV-VLPs-E290后，提呈PPV-VLPs-E290的过程。结果显示，在体内和体外DC均能有效捕获PPV-VLPs，PPV-VLPs可与晚期内吞体相关蛋白分子Lamp2及Rab7的单抗共定位，而与Rab5、Rab11不共定位；氯丙嗪、DEC-205抗体及CD64的抗体对DC的内吞无影响，而经二甲基氨基吡咪、菲律平、及松胞素D及肌动蛋白抗体、caveolin-1抗体处理的DC对PPV-VLPs-E290内吞效率明显下降。放线菌酮、氯喹、乳胞素、布雷菲德菌素对提呈明显抑制，胃酶抑素可部分抑制，而伯氨喹、亮抑肽酶则对DC的提呈效率无影响。表明DC可通过交叉提呈的方式提呈PPV-VLPs-E290，对PPV-VLPs-E290的捕获与肌动蛋白及巨胞饮、小窝蛋白介导的内吞方式有关，而与网格蛋白介导的内吞方式无关；被DC捕获后，定位于DC的晚期内吞体；晚期内吞体的酸性环境、蛋白酶的水解均与PPV-VLPs-E290的提呈有关。