大豆C3H2C3型泛素化连接酶基因GmRHF在抗胞囊线虫中的功能研究

A cDNA clone was screened which encoded C3H2C3 type RING finger E3 ubiquitin ligase gene(temporarily named GmRHF) in the preliminary study, and the gene showed could be involved in compatible interactions between Xiaoliheidou and soybean cyst nematode(SCN). In order to clarify the molecular mechanism of the gene in soybean and nematode interaction, the project will carry out the following research: 1. RACE technique will be applied to clone GmRHF full-length cDNA, then the sequence analysis to illustrate the genetic structure and position on chromosome. Subcellular localization result will be combined in the futher study to identify the GmRHF characteristics and position in plant cell; 2. qRT-PCR will be used to examine GmRHF gene transcription levle in the different organization of susceptible and resistant soybean varieties, and state expression type in resistance to SCN; 3. The vitro ubiquitin experiment will be used to clear the gene ubiquitin ligase activity; 4. Transgenic tobacco plants overexpressing GmRHF will be inoculated with SCN to verify signal transduction pathway which GmRHF involved in disease resistance responses, as well as the role to soybean cyst nematode. This project will reveal the role and molecular mechanism of C3H2C3-type ubiquitin ligase gene in SCN resistance reaction.

本课题前期筛选到一个编码C3H2C3-型RING finger E3连接酶基因（暂时命名为GmRHF）的cDNA克隆，经初步分析该基因可能参与小粒黑豆与大豆胞囊线虫（SCN）非亲和性互作。为进一步探明该基因在介导大豆与胞囊线虫互作的分子机制，本课题将开展以下研究：1.利用RACE技术，克隆GmRHF的cDNA全长，进行序列分析，揭示该基因结构及在染色体上的定位；进一步利用亚细胞定位分析，明确GmRHF基因在细胞中的位置；2. 利用qRT-PCR分析GmRHF在抗、感大豆品种组织中的转录水平，明确其在SCN诱导下的时空表达类型；3.利用体外泛素化实验明确该基因泛素连接酶的活性；4. 将GmRHF基因在烟草中过量表达，接种SCN进行抗性鉴定，探明GmRHF基因参与调控的抗病反应信号传导途径及在抗SCN的作用。本课题将揭示C3H2C3-型泛素连接酶基因在大豆抗胞囊线虫病中的作用机制。

E3 泛素连接酶被认为是植物细胞生长、发育、凋亡以及生物和非生物胁迫反应等生物学进程的关键调控因子。然而，在大豆胞囊线虫（Heterodera glycines，soybean cyst nematode，SCN）病中的作用机制尚不明确。基于SSH表达文库、转录组及蛋白质数据分析，筛选到一个C3H2C3型E3泛素连接酶基因GmRHF。本项目开展以下研究内容：1. 从抗、感大豆品种中克隆GmRHF的CDS区，进行基因结构及生物信息学分析，qRT-PCR分析在不同抗病品种根部组织中的转录水平；2. GmRHF蛋白在烟草中的亚细胞定位；3. 检测该蛋白的体外泛素化活性；4. 探索GmRHF在大豆中过表达后对H. glycines的发育影响情况及基因介导的信号传导通路。. 研究发现GmRHF位于大豆基因组3号染色体上，具有一个外显子，编码260个氨基酸，含有一个RING H2 模体和一个TM跨膜结构域，属于RING H2 zinc finger ATL3 类。在GmRHF转录起始位点上游的启动子元件发现CGTCA-motif和TGACG-motif参与茉莉酸反应的顺式调控元件，以及TC-rich repeats（ATTCTCTAAC）参与防御和应激反应的顺式作用元件。qRT-PCR分析表明在接种H. glycines后12 h ~72 h，根尖组织 GmRHF表达上调，与未接种组织差异均达到显著性（P< 0.05）。构建GmRHF与GFP融合的瞬时表达载体并转化烟草，激光共聚焦显微镜观察发现P35S-EGFP-GmRHF融合蛋白分布在细胞核和细胞质中。构建pET30a-GmRHF融和表达载体并转化大肠杆菌表达融合蛋白，蛋白纯化后进行泛素连接酶活性检测，结果显示GmRHF具有泛素连接酶活性。构建pNI9001-GmRHF载体，发根农杆菌介导的大豆下胚轴转化诱导荧光毛状根。GmRHF在毛状根中的过表达，提高感病品种Williams 82对H. glycines的抗性，减缓H. glycines在植株根内的发育。此外，茉莉酸（JA）和JA-Ile的含量在转基因大豆中增加，表明茉莉酸（JA）和茉莉酸（JA- Ile）含量的影响是其抗性的主要原因。