贵州关岭牛UCP3基因转录因子筛选及调控机制的研究

With the function of the transport protons, UCP gene family can cause "proton leak", which mainly distributed in the mitochondrial membrane, including UCP1, UCP2, UCP3, UCP4, UCP5 and UCP6. UCP3 plays an important role in the animal metabolism and metabolism of fatty acids, is one of the important target protein involved in skeletal muscle energy metabolism, has significant effect on the body's energy balance lead to obesity, resting metabolic rate and body fat metabolism, which makes UCP3 promoter region of transcription factors become the hotspot and development direction. We studied UCP3 expression spectrum and start–up activity in cattle organizations, definited the core area of UCP3 promoter and discussed the tissue specificity of UCP3 promoter at molecular and cellular level.On the basis of previous work, this topic mainly researches related transcription factors of UCP3 promoter, definites transcription factor binding sites of UCP3, cloning and purification transcription factors, construction expression vector,understands the structure of transcription factors, draws transcription factors of structure and analyzes molecular mechanism of interaction between transcription factors and the promoter. It will provide a new way in the UCP3 gene function research and beef cattle breed improvement.

UCP基因家族包括 UCP1、UCP2、UCP3、UCP4、UCP5 和UCP6,主要分布在线粒体内膜，具备线粒体内膜转运质子的功能，可引起“质子泄漏”的产生。UCP3在动物的基础代谢和脂肪酸代谢中具有重要作用，是参与骨骼肌能量代谢的重要靶蛋白物质，对机体能量平衡导致肥胖、静止代谢率以及体脂代谢等作用的调控具有显著影响，这使得与UCP3启动子区相结合的转录因子研究成为人们关注的热点和发展方向。本课题组研究了UCP3在牛各组织中的表达谱及其各片段的启动活性，明确了UCP3启动子的核心区。在前期工作的基础上，本课题主要研究与贵州关岭牛UCP3组织特异性相关的转录因子，明确UCP3启动子区转录因子结合位点，克隆并纯化转录因子，构建表达载体；弄清转录因子结构，绘制转录因子的结构图；解析转录因子-启动子相互作用的分子机制，这将为UCP3基因功能的研究和肉牛品种改良提供新的思路。

启动子作为真核生物基因表达调控的顺式作用元件，含有基因表达调控网络的重要信息，决定基因表达的强度及特异性。解偶联蛋白3（Uncoupling protein 3，UCP3）基因属于解偶联蛋白（uncoupling protein, UCP）基因家族，UCP3基因定位于SSC9P24，是线粒体内的重要转运蛋白，主要在骨骼肌和棕色脂肪组织中表达。UCP3蛋白是参与骨骼肌能量代谢的重要靶蛋白物质，对机体能量失衡导致肥胖、静止代谢率以及体脂代谢等作用的调控具有显著影响。. 本研究以贵州本地牛种关岭牛为研究对象，通过PCR扩增牛UCP3基因不同长度片段启动子序列，检测不同片段长度UCP3 启动子活性，确定UCP3启动子核心区；利用探针和启动子与转录因子竞争性结合的方法筛选UCP3基因启动子区的转录因子结合位点，并结合生物信息学方法对关岭牛UCP3启动子序列进行分析，从而确定UCP3启动子区的转录因子结合位点；通过克隆关岭牛MyoD家族和MEF2A转录因子，构建含启动子的报告基因,并在小鼠的成肌细胞C2C12中利用报告基因的双荧光素酶法研究转录因子MyoD家族和MEF2A转对UCP3基因启动子活性的影响，成功构建UCP3基因启动子的转基因小鼠模型，以期为牛UCP3基因特异性转录调控机制的研究奠定基础。实验结果表明：成功构建关岭牛pGL3-ucp3-pro, PGL3-promoter-ucp3-pro和PEGFP-N3-ucp3-pro载体 ，结果推测P6 (389 bp, -385～+3 bp)可能为UCP3启动子核心区，-433～-385bp区可能存在正调控元件，-620～-433bp区可能存在负调控元件，成功筛选出关岭牛UCP3启动子区有MyoD、TFIID、Pax3、MEF1、MEF2转录因子结合位点，发现Myf5、Myf6和MyoD对关岭牛UCP3启动子的启动活性有一定正调控作用。成功获得了pEGFP-N3-UCP3-pro转基因的阳性小鼠，证明线性化的pEGFP-N3-UCP3-pro重组载体能够整合到小鼠体内，为进一步研究UCP3基因启动子的功能提供技术支持。