基于激光俘获显微切割的涎腺腺样囊性癌肺转移相关基因表达谱的构建

本项目针对临床上原发涎腺腺样囊性癌(adenoid cystic carcinoma, ACC)且伴有肺转移的病例，拟通过细针穿刺抽吸活检术，在明确病理诊断的同时，获得肺转移灶与原发灶的肿瘤标本。利用激光俘获显微切割技术分别获得肺转移灶及原发灶的纯一ACC肿瘤细胞群，进而结合RNA线性扩增及人全基因组芯片技术构建出ACC肺转移相关基因表达谱。采用实时定量PCR、Western Blot、免疫组织化学等技术验证基因表达谱芯片筛选结果；并通过聚类分析软件、在线基因功能分析软件等生物信息学方法对获得的ACC肺转移相关表达基因谱进行分析，寻找重要的ACC肺转移相关基因。本研究有助于进一步阐明腺样囊性癌肺转移的机理，为临床上控制其侵袭、转移提供实验依据。

本项目收集临床上涎腺腺样囊性癌原发灶及自身肺转移瘤穿刺标本共4组，切连续冰冻切片，经H&E染色，利用激光俘获显微切割技术，精确俘获原发灶及肺转移瘤内腺样囊性癌纯一细胞群，每组肿瘤细胞群各俘获约15,000个细胞，提取激光俘获细胞总RNA并鉴定，经下一代高通量测序，获得肺转移瘤相对原发灶差异表达基因及差异表达基因转录本，并经qRT-PCR技术加以验证。运用生物信息学，分析共同差异表达基因及转录本的功能。本项目还以涎腺腺样囊性癌肺高转移细胞株ACC-M为实验组，其亲本低转移细胞系ACC-2为对照，利用高通量miRNA微阵列芯片及基因芯片，筛选出一组涎腺腺样囊性癌肺转移相关miRNA及基因，经qRT-PCR技术加以验证。运用miRNA靶基因预测软件，预测其可能调控的靶基因。运用生物信息学方法，分析肺转移相关基因的功能。. 本项目成功构建了基于激光俘获显微切割的涎腺腺样囊性癌肺转移相关基因表达谱，其中4组样本均共同差异表达的基因为23个（均为下调基因，DKK3、CCL4L1、LSP1、GNLY、Tenascin C、CYB5R2、CD38、HOPX等），共同差异表达的转录本为8个（1个上调，为SRRM2；7个下调，SMAD4等）。经过后续生物信息学分析，获得了共同差异表达基因的功能富集图；获得了共同差异表达基因转录本的可变剪接，发现融合基因。miRNA芯片检测发现，与ACC-2细胞株相比，肺高转移细胞株ACC-M差异表达的miRNA共38个，表达上调的20个（hsa-miR-4487等），下调的18个（hsa-miR-211-3p等）。预测hsa-miR-211其靶基因包括：Notch-3、TGF-β1、CD99、MAPK1、NCAM-1等。基因芯片检测发现，与ACC-2细胞株相比，肺高转移细胞株ACC-M差异表达的基因共1128个，表达上调的448个（PIK3CA、PTPN11、MMP7、CD274等），下调的680个（TGF-β1、NTRK1、IFNA1、PIK3R1等）,下调基因主要富集在 “Apoptosis”和“Cytokine-cytokine receptor interaction”通路中。PPI网络分析显示，PIK3CA、PTPN11 和PIK3R1是关键的相互作用节点。 本项目已发表论文8篇，其中SCI收录3篇，另有1篇SCI论文已接受。