新疆小花棘豆活性成分对奶牛乳腺炎性葡萄球菌生物膜形成的影响及其机制研究

Staphylococci are major pathogens causing dairy cow mastitis.Biofilm formation in the udder gland tissue by Staphylococci may be a leading reason which could result in a chronic and re-appearing infection in the same quarter. It is a purpose that how to screen a novel drug against dairy cow mastitis and to come up with a new strategy for bovine mastitis from the perspect of anti biofilm formation. Based on the findings of our group before, the primary result showed that the liquor of glabrous crazyweed herb, a local Chinese medicine herb in the southern Xinjiang, inhibited the biofilm formation by isolated strains of Staphylococcus epidermidis while did not affect the cell growth. Based on this research, this project would futher explore the effect of active components in glabrous crazyweed herb on biofilm formation by Staphylococci causing dairy cow mastitis, and then reveal the mechanisms of effect on biofilm formation in the level of gene in order to come up with a novel preventive strategy against staphyloccus-related infections, novel drug screen and dairy cow mastitis from the perspect of anti-biofilm.

葡萄球菌是奶牛乳腺炎的主要病原菌。葡萄球菌在乳腺组织形成生物膜是导致奶牛乳腺炎反复发作且难以治愈的重要原因。如何从抗生物膜形成角度筛选治疗奶牛乳房炎新药并提出新的防制策略是奶牛乳房炎防制的新目标。本项目在前期研究的基础之上，初步发现新疆特色中草药小花棘豆水煎液在不影响分离自奶牛乳腺炎表皮葡萄球菌生长的前提下，明显抑制其生物膜的形成。本项目拟在此基础上，进一步探索新疆小花棘豆活性成分对奶牛乳腺炎性葡萄球菌生物膜形成的影响，并采用基因定量表达检测技术（实时定量PCR技术、Northern杂交技术等）从基因水平揭示其影响机制，从而为葡萄球菌生物膜相关感染的防制、新药的筛选以及从抗生物膜形成角度探索新的奶牛乳腺炎防制策略奠定理论基础。

葡萄球菌是奶牛乳腺炎主要病原菌。葡萄球菌在乳腺组织形成生物膜是导致奶牛乳腺炎反复发作且难以治愈的重要原因。如何从抗生物膜形成角度筛选治疗奶牛乳腺炎新药并提出新的防制策略是奶牛乳腺炎防制新目标。本项目采用传统分离培养技术和分子生物学技术完成了本地区奶牛乳腺炎性葡萄球菌分离鉴定，获得56株表葡菌和112株金葡菌。完成了葡萄球菌生物膜形成表型及相关基因检测。22株表葡菌、31株金葡菌能形成生物膜。所有表葡菌均不含ica基因，15株金葡菌含ica基因。表葡菌生物膜阳性菌株数占PCR阳性菌株数比例为：aap，57%；bhp，75%；atlE，55%；sarA，44%；fbe，50%；15株金葡菌含有ica基因，占检测菌株总数的13.3%。金葡菌生物膜阳性菌株数占PCR阳性菌株数比例为：ica，13.3%；ccp，13.7%；bap，5.8%；luxS，17.6%；sarA，16.7%；sigB，10.5%；agrC，0%；tcaR，8.3%。完成了不同因素对葡萄球菌生物膜形成的影响。3%左右胰蛋白胨大豆肉汤培养基最有利于表葡菌生物膜形成；氯化钠对表葡菌生物膜形成有明显抑制，但对金葡菌生物膜形成则有一定促进作用；pH值大于7时，葡萄球菌生物膜形成能力明显减弱。0.2%及以上Ca2+浓度与8%及以上乳糖对葡萄球菌生物膜形成有明显抑制。外源添加酪蛋白对表葡菌生物膜形成没有明显影响，但对金葡菌生物膜形成有一定抑制。完成了新疆南疆地区特色中草药甘草及小花棘豆水煎液对葡萄球菌生物膜形成影响。15%及以上浓度甘草水煎液能通过抑制菌株生长影响葡萄球菌生物膜形成；7.5%小花棘豆水煎液不影响菌株生长情况但明显抑制葡萄球菌生物膜形成。确定了小花棘豆抑制表葡菌生物膜形成主要活性成分为生物碱类，揭示了抑制机制：在ica依赖型生物膜形成机制中，小花棘豆活性成分通过下调icaB或上调icaR基因表达、使胞间多糖黏附素合成量降低而抑制生物膜形成；在ica非依赖型生物膜形成机制中，通过下调aap基因表达、降低细胞聚集作用而抑制生物膜形成。本项目研究结果为葡萄球菌生物膜相关感染防制、新药筛选以及从抗生物膜形成角度探索新的奶牛乳腺炎防制策略提供了实验依据。