秋茄耐盐分子网络解析及抗盐相关功能基因研究

秋茄是一种天然耐盐植物，针对在理论和实践上有重要意义的秋茄耐盐分子机理开展研究。采用双向电泳、Blue Native PAGE、质谱技术、FQ-PCR技术、Western blotting 技术、生物信息学手段比较分析不同浓度盐胁迫下红树植物秋茄根、叶以及叶绿体、线粒体蛋白质组的差异变化，并对差异蛋白表达模块进行分类，研究其和耐盐的相互关系，从而揭示秋茄的耐盐功能蛋白质相互之间的网络调控关系。本项目还结合抑制消减杂交（SSH）技术、Northern 技术研究秋茄基因差异表达。综合分析秋茄耐盐相关功能蛋白与功能基因的差异表达模式、相互关系及作用规律，弄清秋茄耐盐分子调控网络，这对于阐明红树植物耐盐分子机理具有重要理论意义，并为其它木本植物耐盐的相关研究提供参考。通过克隆与耐盐密切相关的基因并分析其功能，为耐盐植物育种（尤其是木本植物）提供分子生物学研究基础。

本研究以耐盐木本植物秋茄为试材，运用蛋白质组学和转录组技术方法分析了盐胁迫下秋茄叶片、叶绿体和线粒体差异蛋白质组以及秋茄叶片和根系转录组变化，对秋茄耐盐分子机理开展研究。建立了秋茄完整叶绿体、线粒体的分离与叶、根系总蛋白提取及双向电泳体系。对不同浓度盐胁迫下秋茄叶、根和线粒体蛋白质组进行双向电泳分析，2-DE图谱上检测到叶片差异蛋白53个、根系差异蛋白42个、线粒体差异蛋白96个。iTRAQ定量蛋白质组学技术对不同浓度盐胁迫下秋茄叶和叶绿体的差异蛋白质组进行研究，分别鉴定并定量了2698和1030个蛋白质。叶绿体蛋白质组共有76个蛋白显著变化达到1.5倍以上，其中36个参与光合作用的光反应，12个参与碳反应。差异表达蛋白质的生物学功能分析表明光合作用，呼吸和能量代谢，解毒和抗氧化，钠离子区室化，蛋白折叠与组装，信号转导相关蛋白与秋茄耐盐关系密切。运用RNA-seq技术对不同浓度盐胁迫下秋茄叶和根的差异基因进行研究，分别共获得差异表达基因6285和3428个（差异倍数≥2），显著富集的pathway分别有33和20个（P-value<0.05）。差异表达基因的生物学功能分析表明信号转导、转录因子、离子转运、渗透调节、DNA修复和光合作用途径相关的基因与秋茄耐盐分子调控网络密切相关，其耐盐机理与耐盐草本植物有明显不同。本研究还对以上代谢途径相关的基因和蛋白进行了qRT-PCR和western blot验证分析。应用RACE方法克隆了与秋茄耐盐相关的mangrin和V-ATP酶2个基因，并获到耐盐转基因植株。综合分析秋茄耐盐相关功能蛋白与功能基因的差异表达模式、相互关系及作用规律，我们发现在高盐胁迫下影响秋茄光合作用的限制因子是碳反应，而不是光反应。此外，我们还发现在高盐胁迫下的信号传导系统有磷酸肌醇信号通路参与，而在适度盐胁迫下主要是钙信号通路在起作用。以及在盐胁迫下秋茄苯丙烷、类黄酮和萜类代谢加强，这在草本耐盐植物中未见报道。本研究的完成对揭示秋茄耐盐的分子机理有着重要理论意义，并为今后运用转基因技术将红树植物耐盐相关基因转入主要作物或林木奠定了分子生物学基础。