改造转录调控蛋白设计构建小分子生物传感器及其在天然产物生物合成研究中的应用

Biosensors for real-time monitoring of intracellular small-molecule concentrations are of great importance in natural product biosynthesis studies. Herein, a small molecule biosensor will be developed by engineering the specificity of a transcriptional regulatory protein, and then applied in natural product biosynthesis studies. Hydroxytyrosol is a natural polyphenol antioxidant, and its heterologous biosynthesis in microbial cells is of low efficiency. PadR, a Bacillus subtilis transcriptional regulatory protein, regulates gene expression in response to phenolic acids. In this study, with both rational design and directed evolution strategies, PadR will be engineered to activate the expression of fluorescent protein gene upon binding hydroxytyrosol, so that it can be used as a hydroxytyrosol biosensor which can report the intracellular hydroxytyrosol concentrations through cell fluorescence. This hydroxytyrosol biosensor will be used as a high-throughput screening tool to engineer the 4-hydroxyphenylacetic acid-3-hydroxylase in a designed hydroxytyrosol biosynthetic pathway, for improved activity in converting tyrosine to L-DOPA. This mutant enzyme will be used to replace the tetrahydrobiopterin-dependent tyrosine hydroxylase in the original pathway, leading to improved hydroxytyrosol yield. In addition, the biosensor will also be used to optimize the genome for higher hydroxytyrosol biosynthetic efficiency. The method of developing customized biosensors for small molecules used in this study can be applied to other small-molecular compounds. The mutated regulatory proteins, acting as both biosensors and non-natural regulatory elements，is of great significance for synthetic biology research.

可实时快速监测微生物胞内小分子化合物浓度的生物传感器对研究天然产物的生物合成十分重要。本项目拟通过改造转录调控蛋白研制小分子化合物生物传感器，并将其应用于天然产物生物合成研究。羟基酪醇是一种多酚类强抗氧化剂，其生物合成效率尚低。PadR是来自枯草芽孢杆菌响应酚酸的转录调控蛋白，本项目拟结合理性设计和定向进化手段改造其诱导特异性，使之能结合羟基酪醇并启动下游荧光蛋白表达，实时表征胞内羟基酪醇浓度，作为羟基酪醇生物传感器使用。以此为高通量筛选工具，拟对新构建的羟基酪醇生物合成途径中4-羟基苯乙酸-3-羟化酶进行改造，提高其催化酪氨酸生成多巴的活性，从而取代原通路中依赖四氢蝶呤的酪氨酸羟化酶，显著提升羟基酪醇转化率。此外该生物传感器还将用于对工程菌基因组的优化。本项目建立的人工定制生物传感器方法可拓展应用于其它小分子化合物。其作为生物传感器和非天然调控元件的双重功能对合成生物学研究具有重要意义。

可实时快速监测微生物胞内小分子化合物浓度的生物传感器对研究天然产物的生物合成十分重要。本项目拟通过改造转录调控蛋白研制小分子化合物生物传感器，并将其应用于天然产物生物合成研究。羟基酪醇是一种多酚类强抗氧化剂，其生物合成效率尚低。本项目拟结合理性设计和定向进化手段改造来自不同微生物的转录调控蛋白的诱导特异性，使之能结合羟基酪醇并启动下游荧光蛋白表达，实时表征胞内羟基酪醇浓度，作为羟基酪醇生物传感器使用。以此为高通量筛选工具，拟对新构建的羟基酪醇生物合成途径中4-羟基苯乙酸-3-羟化酶进行改造，提高其催化酪氨酸生成多巴的活性，从而取代原通路中依赖四氢蝶呤的酪氨酸羟化酶，显著提升羟基酪醇转化率。此外该生物传感器还将用于对工程菌基因组的优化。我们通过改造来源于谷氨酸棒杆菌的转录调控蛋白VanR，使其能够特异性响应羟基酪醇的诱导，首次成功创制了羟基酪醇的全细胞生物传感器，并将其应用于大肠杆菌中羟基酪醇新生物合成途径的构建及通路关键酶的定向进化，打造了全新的羟基酪醇全细胞催化剂，显著提高了大肠杆菌中羟基酪醇的生物合成效率。在此基础上，我们进一步对转录调控蛋白VanR进行改造研究，使其能够响应天然高价值小分子化合物香草醛的特异性诱导，成功打造了香草醛的全细胞生物传感器，并将其应用于大肠杆菌中香草醛转运蛋白的筛选及相关代谢网络的分析调控，成功实现了大肠杆菌中香草醛的高效绿色生物合成。本项目通过对来源于微生物的转录调控蛋白进行改造筛选，使其天然诱导特异性发生改变，能够特异性响应非天然诱导剂，从而打造目标高值小分子化合物的全细胞生物传感器，进而将其应用于目标高值化合物的高效绿色生物合成研究。本项目的研究成果以论文形式分别发表在Nature Communicaiton, Metabolic Engineering, Journal of Agricultural and Food Chemistry等领域top期刊上。本项目建立的人工定制生物传感器方法可进一步拓展应用于其它小分子化合物，其作为生物传感器和非天然调控元件的双重功能对合成生物学的研究具有重要意义。