FNDC3B作为维甲酸受体α（RARA）基因融合的新配偶体在调控粒细胞分化中的作用及机制

Neutrophils are key players in fighting against microbial infections. They are generated from hematopoietic stem cells (HSCs) through a process termed granulocytic differentiation/granulopoiesis. Errors in this differentiation process not only impair neutrophil development resulting in defective immune responses to pathogens but also lead to the highly fatal blood cancer acute myeloid leukemia (AML). Recently, we identified fibronectin type III domain containing 3B (FNDC3B) as a new RARA (Retinoic Acid Receptor Alpha) fusion partner in a patient with an AML subtype characterized by the fusion of RARA. Our preliminary data highlight CEBPE, which is critical for terminal granulopoiesis, as an important factor regulating FNDC3B transcription in granulocytic cells，and FNDC3B may control terminal granulopoiesis by regulating this crucial ER/granule pathway and caspase-4. Therefore, we hypothesize that, unlike other RARA fusion partners, FNDC3B itself also participates in granulocytic differentiation. In this proposal, we shall study the effects of FNDC3B genetic manipulation on haematopoietic potentials of human HSCs from umbilical cord blood. The cells will be functionally characterized and the underlying mechanisms will be elucidated. Therefore, the better understanding of the differentiation process shall provide new insights into disease pathogenesis and facilitate the development of effective treatments accordingly.

成熟的中性粒细胞来源于人类的造血干细胞，通过粒细胞分化而来，在阻击微生物感染时发挥着重要的作用。如果在分化过程中发生错误，不仅会影响中性粒细胞的成熟导致免疫功能的损坏，还可能会导致迅速致命的血液系统肿瘤，例如急性髓细胞白血病。最近，我们在急性早幼粒白血病患者中发现了新的维甲酸受体α（RARA）基因融合的新配偶体，即FNDC3B。我们的前期数据表明，髓系转录因子（CEBPE）是调节粒细胞中FNDC3B转录表达的重要因子，而后者可通过调节内质网/颗粒蛋白以及Caspase-4的表达与活性来参与粒细胞分化。我们推测，FNDC3B基因自身也参与到粒细胞分化的过程中。在本项目中，我们将研究FNDC3B对人类脐带血造血干细胞的造血潜力在体外和体内的影响，完成功能表征，并进一步阐明其中的机制和原理，从而更全面的探索粒细胞分化过程，为疾病的发生发展和相应的靶向治疗的制定提供新的思路。

我们通过分析AML患者的临床数据发现，FNDC3B的高表达与提示具有良好预后的临床特征高度相关，并通过KM生存曲线证实FNDC3B的高表达提示了良好的总生存期。人脐带血分离的CD34+造血干细胞中FNDC3B的表达随着分化过程逐步升高。我们用ATRA成功诱导NB4和HL60向成熟中心粒细胞分化，可同时引起CEBPe和FNDC3B表达量的上升。敲低FNDC3B后，促进了细胞增殖，细胞周期蛋白CCND1和CCND3的表达也明显增加，同时过表达FNDC3B后，细胞增殖速度明显下降。另一方面，敲低FNDC3B的表达可以阻碍ATRA诱导的粒细胞分化。我们通过点突变分析证实了相比于单核细胞株而言，早幼粒细胞株中CEBPE和Sp1可以更有效的调控FNDC3B 的转录活性，敲低CEBPe后可降低FNDC3B的表达。接着我们通过ChIP证实了在早幼粒细胞株中CEBPe和Sp1与FNDC3B促进子的高度特异性的结合。我们利用GSEA和DAVID功能注释分析，分析了多组AML数据，发现FNDC3B的内源性表达与内质网/高尔基体、蛋白质合成/翻译/修饰/转运/分泌及代谢、颗粒蛋白合成与分泌、内质网应激等生物学过程高度相关，进一步我们通过RNA测序显示，敲低FNDC3B可下调颗粒蛋白基因与内质网相关的结构和功能基因的表达。通过qPCR和WB验证，前者包括LYZ, MMP2, CTSB, EPX, MMP25等，后者包括PDIA3, CERCAM, HSP90B1, CALR, HSPA5等。同时，溶菌酶活性实验与髓过氧化物酶染色实验也证实在敲低FNDC3B后，两者的活性均明显下降。另外，在正常髓细胞的分化中，Caspase-4的表达将逐渐上升，敲低FNDC3B后可引起Caspase-4的表达下降。Tunicamycin能成功激活Caspase-4来诱导内质网应激，从而引起细胞凋亡。而敲低FNDC3B可有效阻碍Tunicamycin诱导的Caspase 4的激活及内质网应激效应。综上所述，我们证实了 FNDC3B 在粒细胞分化中的重要作用，揭示髓系分化的重要转录因子 CEBPE 和 Sp1 可有效的控制FNDC3B 的转录表达，并阐明了 FNDC3B 将通过内质网/颗粒蛋白通路以及内质网应激/Caspase-4 通路实现对粒细胞的分化的重要调控。