中医补肾填髓法修复阿尔茨海默病海马突触损害及其机制研究

Alzheimer's disease (AD) is the most common of old age dementia, the incidence rate of AD has presented an ascending tendency in recent years, which is emphasizing the need for improvements in therapeutic options. Traditional Chinese medicine has an important role in the treatment of AD, which Bushen Tiansui therapy is the main method for AD, however, there is a relative lack of accurate mechanism available. Since the synaptic damage in brain is the most direct reason for the cognitive defect of AD, blocking synaptic damage becomes the main effective means of dementia treatment. Brain derived neurotrophic factor (BDNF) plays an important role in synaptic survival, maintain and repair. Our team is engaged in clinical and experimental research in the treatment of AD by using Bushen Tiansui therapy. Based on the previous studies, we propose the hypothesis that "Bushen Tiansui therapy can repair the damaged synaptic and resistance dementia through the influence to miRNAs expression which target is BDNF mRNA." To reveal the molecular mechanism of Bushen Tiansui therapy treatment based on BDNF gene expression in a post-transcription process, we screen and demonstrate those miRNAs which can target BDNF gene expression in vitro and in vivo experiment, integrating genomics, bioinformatics molecular biology and the cell biology technology, which providing a new ideas and methods for Traditional Chinese medicine treatment of AD.

阿尔茨海默病（AD）是老年期痴呆中最常见疾病，其发病率逐年上升，因此AD的预治研究具有重要意义。中医辩证施治在AD治疗中有着重要的地位，补肾填髓法是中医治疗AD的基本方法，但其疗效机制仍需进一步研究。神经突触损害是AD认知功能缺失最直接的原因，修复损伤突触是抗痴呆治疗的有效手段之一，脑源性神经营养因子（BDNF）在突触的生存、功能维持和修复方面起重要作用。项目组长期从事中医补肾填髓法治疗AD的临床和实验研究，本项目是在前期研究基础上，提出"补肾填髓法可能通过影响以BDNFmRNA为标靶的miRNAs表达，修复损伤突触，发挥抗痴呆效用"的假说。项目拟以补肾填髓方药为实验材料，集成动物行为学、生物信息学、分子生物学、细胞生物学、神经电生理学等领域的先进技术，筛选、验证补肾填髓法干预的以BDNFmRNA为标靶的miRNAs，阐述补肾填髓法修复损伤突触的机制，为中医药治疗AD提供新的思路和方法。

阿尔茨海默病（AD）是最常见的老年期痴呆，目前尚缺乏有效的治疗措施。大量的研究证据表明中医补肾填髓法治疗阿尔茨海默病（AD）有较好疗效。但是其作用机制并不十分清楚。基于课题组前期研究结果，我们提出“补肾填髓法可能通过影响以 BDNF mRNA为标靶的 miRNAs 表达，修复损伤突触，发挥抗痴呆效用”的假说。首先我们通过双侧侧脑室注射Aβ1-42复制AD大鼠模型，并经Morris水迷宫确认造模成功，同时通过HPLC法测定补肾填髓方冻干粉主要成分及含量的研究，并运用LC/MS-Q-TOF技术对补肾填髓方进行了质量控制，从而保证了实验的可重复性。其次，我们通过大鼠的miRCURY LNA™ microRNA 芯片，构建AD模型大鼠海马区BDNF阳性区域miRNA表达谱，利用Fold change>= 1.5和P-value<= 0.05进行差异miRNAs挑选，结果显示：上调93个，下调96个。通过检索miRNAs靶基因预测数据库，结合芯片筛查结果，最终筛选确定miR-206-3p，miR-10a-5p，miR-1b 以BDNF mRNA为标靶的miRNAs。接着，我们以miR-10a-5p为例，进行以BDNF mRNA为标靶的Aβ改变表达的候选miRNAs的验证，同时进行了体外研究。证实miR-10a-5p 可以通过直接与 BDNF mRNA 特异性结合抑制其翻译起到负调控 BNDF 基因的作用。同时，也证实补肾填髓方能通过下调 AD 模型细胞中 miR-10-5p 表达靶向增加 BDNF mRNA 从而提高 BDNF 表达，发挥拮抗 Aβ 下调 BDNF表达的作用。最后我们通过开展补肾填髓方及主要药效成分淫羊藿苷的药效学实验，证实①补肾填髓方通过能够逆转 Aβ诱导的海马内 PSD95、NR2B、 Shank1 蛋白的表达，改善突触结构与功能，达到防治 AD的作用。②淫羊藿苷通过激活PI3K/Akt信号通路，调节细胞凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、caspase-3的表达来拮抗Aβ诱导的细胞凋亡。③淫羊藿苷通过BDNF/TrkB/Akt信号通路修复Aβ诱导AD模型大鼠突触损伤，改善AD模型大鼠认知功能。综上所述，通过本研究基本证实了补肾填髓法可能通过影响以 BDNF mRNA为标靶的 miRNAs 表达，修复损伤突触，发挥抗痴呆效用。