眼针调控神经细胞自噬作用改善脑缺血再灌注损伤的机制研究

Stroke is a hazard to health and life quality of patient seriously, and cerebral ischemia reperfusion injury (CIRI) is an important pathophysiological process of stroke. Papers showed that cell oxidative stress produced a large number of oxygen free radicals after reperfusion. If oxygen free radicals were removed, autophagy could weaken. Our team found eye acupuncture could oxygen free radicals effectively; then ultrastructure of CIRI model rats treated by eye acupuncture was observed, we found autophagy appeared in nerve cells. All the results showed eye acupuncture improving CIRI may be associated with regulation of autophagy. So we speculate eye acupuncture treat CIRI through regulating autophagy to restore balance. In this project, we observe and investigate the mechanism of eye acupuncture regulating autophagy of CIRI rats, through autophagy inhibitor 3-MA treating CIRI model rats and PC12 cells and determine the morphological changes and molecular biological index from two levels of the whole and cells. If this project accomplishes, it would provide experimental basis for eye acupuncture treating stroke, and establish theoretical foundation for spread of eye acupuncture.

脑中风病严重危害患者的健康和生活质量，脑缺血再灌注损伤（CIRI）是其重要的病理生理过程。文献表明再灌注后细胞发生氧化应激，产生大量氧自由基，清除氧自由基能够减少自噬发生。本项目组在前期研究“眼针疗法”治疗脑中风病机制的过程中首次发现眼针治疗CIRI可有效清除氧自由基；对眼针治疗的CIRI模型大鼠进行超微结构观察，可见神经细胞中有自噬体的出现，以上实验结果提示眼针治疗CIRI可能与自噬的调控有关。为此，我们推测——眼针治疗脑缺血再灌注损伤可能是通过调控自噬使机体自噬重新恢复平衡实现的。本项目通过构建CIRI大鼠模型及PC12细胞体外CIRI模型并应用自噬抑制剂3-MA处理，通过形态学观察、分子生物学等技术检测，从整体和细胞两个层次，对比观察眼针对CIRI大鼠自噬的调控，并探讨其机制。本项目的完成，将从自噬角度为眼针治疗脑中风病提供实验依据，为其广泛推广奠定理论基础。

脑中风病严重危害患者的健康和生活质量。“眼针疗法”是我校彭静山教授基于中医学眼与全身五脏六腑相关联等理论创立的，其治疗脑中风病目前已得到了学术界的公认。40多年的百余万病例证明，眼针操作简便易行、安全可靠，临床对40余种疾病具有疗效，特别是治疗脑中风效果显著，但是其机制尚未完全阐明。为了更好的发挥眼针疗法在重大疑难疾病防治方面的巨大优势，本项目根据“眼针疗法”治疗脑中风病有效以及自噬参与大鼠脑缺血再灌注损伤，针对眼针是否通过调控神经细胞自噬起到治疗作用，探讨眼针疗法的作用机制。. 采用改良的大脑中动脉栓塞术构建CIRI大鼠模型及原代培养神经元细胞建立体外CIRI模型并应用自噬抑制剂3-MA处理，通过形态学观察、分子生物学等技术检测，从整体和细胞两个层次，采用电镜观察眼针治疗前后CIRI自噬小体形成情况；采用Western blot方法及免疫组化方法观察眼针治疗前后自噬相关蛋白在神经细胞的表达水平。结果表明：模型组神经功能缺损评分上升，脑梗死灶体积较大，眼针组较模型组神经功能缺损评分明显有所下降，脑梗死灶体积变小；电镜观察模型组可见较多自噬小体，眼针组较模型组减少；模型组LC3（LC3-I/ LC3-II）、Beclin1、ATG1、ATG4、ATG5、ATG7、ATG12蛋白表达升高，眼针组较模型组表达下降；模型组p62 蛋白表达下降，眼针组p62 蛋白表达明显升高；差异均具有统计学差异（P＜0.05）。故得出如下结论，CIRI能够上调模型大鼠脑组织神经细胞自噬水平，而眼针干预能够下调自噬水平，并显著改善大鼠脑缺血再灌注损伤，因此其机制可能与调控CIRI大鼠神经细胞过度自噬有关。本项目进一步揭示了眼针疗法的有效性、客观性、科学性，为临床医生进一步推广眼针疗法治疗脑中风病奠定了理论基础，具有重要的经济效益和社会效益。